谢睿锋 李 岩 王 东

    1.山西医科大学，山西太原 030000；2.山西医科大学第二医院骨科，山西太原 030000

    随着人类寿命的逐渐延长，我国开始进入老龄化国家。骨质疏松症越来越突出地影响老年人的生活质量。随着学者对于氧化应激在骨质疏松发病机制中的进一步研究，应用抗氧化剂茶多酚预防和治疗骨质疏松逐步成为国内外研究的新热点之一。有证据显示茶多酚具有抗氧化的作用，可通过抑制氧化应激反应而减少骨量流失，从而起到预防治疗骨质疏松的作用[1，2]。茶多酚中含有75%～80%的儿茶素，有研究已证实在儿茶素成分中表儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechgin gallate，EGCG)是其中含量最多并且药用活性最强的成分[3]。本研究通过分离和培养新生SD大鼠颅骨诱导的成骨细胞，研究在体外环境下EGCG对新生SD大鼠成骨细胞的作用，寻找EGCG的作用浓度，即促进浓度或抑制浓度，为EGCG应用于临床预防及治疗骨质疏松提供数据依据。

    1 材料与方法

    1.1 材料来源

    出生3 d内的SD大鼠，由山西医科大学实验动物中心提供。EGCG、Ⅱ型胶原酶、胰酶(北京索莱宝科技有限公司)；DMEM 培养基(Hyclone，USA)；胎牛血清(四季青生物工程材料有限公司)；成骨诱导分化培养基试剂盒 (赛业生物科技有限公司)；CCK-8试剂盒(同仁化学研究所)；VEGF ELISA试剂盒(上海西塘生物科技有限公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 细胞培养 取新生3 d以内的健康SD大鼠，处死后在无菌条件下切下颅骨，剥除骨膜等软组织，将颅骨充分剪碎，PBS冲洗，加入1%的胰蛋白酶消化10 min后加DMEM培养基终止消化，弃去消化液；加入0.2%胶原酶Ⅱ处理30 min，弃去消化液；加入0.2%胶原酶Ⅱ处理60 min，将消化液移入15 mL离心管中，室温条件下1500 r/min离心5 min；弃上清，加入含10%胎牛血清的DMEM 3.5 mL培养液，制成细胞悬液，将细胞悬液移入细胞培养瓶中，放于37℃、5%CO2分压的细胞培养箱中培养。细胞培养过程中，常规隔天换液。待细胞铺满瓶底后吸出培养液，用0.25%的胰蛋白酶消化，进行传代培养。使用第三代细胞进行实验。 用成骨诱导液将 EGCG 配制为：0、1、10、20、30、40 μmol/L。

    1.2.2 细胞增殖分析 经0.25%胰蛋白酶消化的第三代干细胞，以细胞数5×104个/mL接种于96孔培养板中， 每孔 100 μL ......