安捷伦食品安全之“僵尸肉”鉴别完整自动化解决方案(1)
“僵尸肉”一词，最早源于2015年6月23日新闻报道的《走私“僵尸肉”窜上餐桌，谁之过？》一文。“僵尸肉”由于其冷冻时间长、运输及储存条件恶劣，容易滋生各种细菌，甚至发生腐烂。而这些肉一旦被搬上餐桌，将极大地危害消费者的身体健康，所以需要对“僵尸肉”进行极为严格的管控。
在监管法规方面，目前GB 2707-2005 《鲜(冻)畜肉卫生标准》和GB/ T 17238-2008 《鲜、冻分割牛肉》等标准多通过感官检测的方法进行判断。但是感官检测对人的感官灵敏度有较高要求，同时要求具有一定的检测经验，需要长期的积累，因此准确性及科学性等方面存在一定问题。为有效改善冷鲜肉检测当前面临的问题，急需建立科学的仪器检测方法并逐步形成检测标准来有效推动“僵尸肉”的检测与判别。
1 代谢组学用于鉴别“僵尸肉”的思路
代谢组学经过20年的发展，已成为组间样品小分子代谢物差异研究的一种重要手段，并在诸多领域得到广泛应用，如疾病发生发展、药物开发与疗效、转基因作物等。代谢组学分为非靶向与靶向两个研究层次：非靶向代谢组学通过全谱轮廓差异分析，寻找组间差异化合物并进行鉴定；靶向代谢组学进而对差异化合物进行定量分析，实现大规模样品的验证及差异浓度变化动态范围的研究。由于“僵尸肉”在冷冻时间、储存条件等方面与鲜肉或鲜冻肉之间存在巨大差异，所以在化合物的组成方面也会存在显著区别。M.K. Pettersen等学者2004年发表于Poultry Science的文章“Lipid Oxidation in Frozen， Mechanically Deboned Turkey Meat as Affected by Packaging Parameters and Storage Conditions”中指出，包装以及储存时间的差异会导致脂肪氧化水平的差异。Amy Elizabeth Johnson等学者2018年5月发表于Analytical Chemistry的研究文章“The Metabonomic Profiling of Chicken Eggs During Storage Using High Performance Liquid Chromatography Quadrupole Timeof-Flight Mass Spectrometry”中称，代谢组学方法可以应用于鉴别不同储存时间的鸡蛋，并且发现胆碱可以作为区分不同储存时间的鸡蛋的标志物。同样的方法学也可以应用于“僵尸肉”的鉴别。
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1.1 基于安捷伦UHPLC-QTOF的“僵尸肉”鉴别方案
基于UHPLC-QTOF技术的非靶向代谢组学可为全面了解“僵尸肉”在长时间冷冻后成分的变化提供有效研究手段。首先，使用QTOF对样品进行全谱轮廓分析，尽可能采集所有代谢物响应的信息，然后结合代谢组学软件对数据进行峰提取、对齐、差异分析、差异化合物鉴定等流程分析，最终寻找并鉴定出“僵尸肉”长时间存储与反复冻融导致的变化成分，为“僵尸肉”的检测提供靶標。
除硬件外，鉴别“僵尸肉”还需专业的代谢组学分析软件——Mass Profiler Professional(MPP)，其是在分析质谱数据中发现代谢物生物标志的有效工具，可在大量样品组和复杂的实验设计中方便地进行质谱数据的导入、归一化和比较，包括GC/MS、LC/MS、CE/MS的多种数据。MPP软件可整合多种数据库对未知物进行定性分析，如安捷伦独有的Metlin、Fiehn及Nist、ChemIDPlus、Pubchem、HMP等公共数据库。MPP软件拥有用于统计分析、数据挖掘和可视化的综合工具，包括：方差分析(ANOVA)、主成分分析(PCA)、t-检验(t-tests)、火山图、树状分级图(系统树图)、自组织图(SOM)、质量阈值(QT)聚类、支持矢量设计(SVM)等。此外，MPP软件支持KEGG、Wikipathway、BioCyc等全面的Pathway数据库匹配，并可根据文献记载自建Pathway，从而达到对代谢物之间的相互作用以及生物功能进行研究的目的。
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MPP结合了先进的处理功能以及强大的统计和数学模型对复杂的质谱数据集进行分析。对于“僵尸肉”的鉴别分析，只需对一系列鲜肉、鲜冻肉以及“僵尸肉”的样品进行测试，使用这些检测结果建立预测模型，然后仅需采集未知肉样的数据放入所建模型，即可对该未知样品进行预测。
如果需要对“僵尸肉“与鲜肉或鲜冻肉之间存在差异的化合物进行明确鉴定，用于后续的靶标性分析，则可按照图3所示流程进行相关分析。
1.2 基于安捷伦UHPLC-QQQ的“僵尸肉”靶标化合物定量方案
M.K. Pettersen等学者2004年发表于Poultry Science的文章“Lipid Oxidation in Frozen， Mechanically Deboned Turkey Meat as Affected by Packaging Parameters and Storage Conditions”中提到，TBARS(硫代巴比妥酸反应物)值在储存时间不同的样品组间存在显著差异，因此可以用该类化合物作为靶标进行定量并作为判别样品储存时间的依据。利用QTOF寻找及鉴定差异化合物只是鉴别“僵尸肉”的一部分，若需进一步确定特征化合物并对其进行定量分析，可采用靶向代谢组学的方法。靶向代谢组学是有目标的对体内特定的一系列内源性化合物进行靶向定量检测与差异比较研究的技术。三重串联四极杆质谱是靶向代谢组学的有利工具，在监测复杂基质中痕量物质的浓度的变化研究、制定相应的监管标准中有巨大优势。
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在监管法规方面，目前GB 2707-2005 《鲜(冻)畜肉卫生标准》和GB/ T 17238-2008 《鲜、冻分割牛肉》等标准多通过感官检测的方法进行判断。但是感官检测对人的感官灵敏度有较高要求，同时要求具有一定的检测经验，需要长期的积累，因此准确性及科学性等方面存在一定问题。为有效改善冷鲜肉检测当前面临的问题，急需建立科学的仪器检测方法并逐步形成检测标准来有效推动“僵尸肉”的检测与判别。
1 代谢组学用于鉴别“僵尸肉”的思路
代谢组学经过20年的发展，已成为组间样品小分子代谢物差异研究的一种重要手段，并在诸多领域得到广泛应用，如疾病发生发展、药物开发与疗效、转基因作物等。代谢组学分为非靶向与靶向两个研究层次：非靶向代谢组学通过全谱轮廓差异分析，寻找组间差异化合物并进行鉴定；靶向代谢组学进而对差异化合物进行定量分析，实现大规模样品的验证及差异浓度变化动态范围的研究。由于“僵尸肉”在冷冻时间、储存条件等方面与鲜肉或鲜冻肉之间存在巨大差异，所以在化合物的组成方面也会存在显著区别。M.K. Pettersen等学者2004年发表于Poultry Science的文章“Lipid Oxidation in Frozen， Mechanically Deboned Turkey Meat as Affected by Packaging Parameters and Storage Conditions”中指出，包装以及储存时间的差异会导致脂肪氧化水平的差异。Amy Elizabeth Johnson等学者2018年5月发表于Analytical Chemistry的研究文章“The Metabonomic Profiling of Chicken Eggs During Storage Using High Performance Liquid Chromatography Quadrupole Timeof-Flight Mass Spectrometry”中称，代谢组学方法可以应用于鉴别不同储存时间的鸡蛋，并且发现胆碱可以作为区分不同储存时间的鸡蛋的标志物。同样的方法学也可以应用于“僵尸肉”的鉴别。
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1.1 基于安捷伦UHPLC-QTOF的“僵尸肉”鉴别方案
基于UHPLC-QTOF技术的非靶向代谢组学可为全面了解“僵尸肉”在长时间冷冻后成分的变化提供有效研究手段。首先，使用QTOF对样品进行全谱轮廓分析，尽可能采集所有代谢物响应的信息，然后结合代谢组学软件对数据进行峰提取、对齐、差异分析、差异化合物鉴定等流程分析，最终寻找并鉴定出“僵尸肉”长时间存储与反复冻融导致的变化成分，为“僵尸肉”的检测提供靶標。
除硬件外，鉴别“僵尸肉”还需专业的代谢组学分析软件——Mass Profiler Professional(MPP)，其是在分析质谱数据中发现代谢物生物标志的有效工具，可在大量样品组和复杂的实验设计中方便地进行质谱数据的导入、归一化和比较，包括GC/MS、LC/MS、CE/MS的多种数据。MPP软件可整合多种数据库对未知物进行定性分析，如安捷伦独有的Metlin、Fiehn及Nist、ChemIDPlus、Pubchem、HMP等公共数据库。MPP软件拥有用于统计分析、数据挖掘和可视化的综合工具，包括：方差分析(ANOVA)、主成分分析(PCA)、t-检验(t-tests)、火山图、树状分级图(系统树图)、自组织图(SOM)、质量阈值(QT)聚类、支持矢量设计(SVM)等。此外，MPP软件支持KEGG、Wikipathway、BioCyc等全面的Pathway数据库匹配，并可根据文献记载自建Pathway，从而达到对代谢物之间的相互作用以及生物功能进行研究的目的。
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MPP结合了先进的处理功能以及强大的统计和数学模型对复杂的质谱数据集进行分析。对于“僵尸肉”的鉴别分析，只需对一系列鲜肉、鲜冻肉以及“僵尸肉”的样品进行测试，使用这些检测结果建立预测模型，然后仅需采集未知肉样的数据放入所建模型，即可对该未知样品进行预测。
如果需要对“僵尸肉“与鲜肉或鲜冻肉之间存在差异的化合物进行明确鉴定，用于后续的靶标性分析，则可按照图3所示流程进行相关分析。
1.2 基于安捷伦UHPLC-QQQ的“僵尸肉”靶标化合物定量方案
M.K. Pettersen等学者2004年发表于Poultry Science的文章“Lipid Oxidation in Frozen， Mechanically Deboned Turkey Meat as Affected by Packaging Parameters and Storage Conditions”中提到，TBARS(硫代巴比妥酸反应物)值在储存时间不同的样品组间存在显著差异，因此可以用该类化合物作为靶标进行定量并作为判别样品储存时间的依据。利用QTOF寻找及鉴定差异化合物只是鉴别“僵尸肉”的一部分，若需进一步确定特征化合物并对其进行定量分析，可采用靶向代谢组学的方法。靶向代谢组学是有目标的对体内特定的一系列内源性化合物进行靶向定量检测与差异比较研究的技术。三重串联四极杆质谱是靶向代谢组学的有利工具，在监测复杂基质中痕量物质的浓度的变化研究、制定相应的监管标准中有巨大优势。
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