乳品中兽药残留荧光检测技术的应用进展(1)
近年来，乳品质量安全事件频发严重威胁着社会公共健康，故成为国际关注的重点。兽药残留是乳品质量管控的重中之重，因为其将直接危害消费者的身体健康。本文介绍了乳品中兽药残留的种类和危害，总结了荧光检测技术在乳品兽药残留检测中的应用，并展望了荧光检测技术在乳品兽药残留检测领域中的发展前景。
乳及乳制品作为一类营养全面的理想食品，能够为人体提供优质的蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素和无机盐等基本营养素。此外，乳制品在人类膳食结构中占有十分重要的地位，尤其是婴幼儿和老人。随着全球经济一体化和食品贸易国际化进程的加快，乳品的质量安全已成为世界性的挑战和全球关注的公共卫生问题。其中，兽药残留问题是影响乳制品安全的重要因素之一。目前，乳品中兽药残留的主要检测方法有微生物检测法、免疫分析法、仪器分析法、适配体传染器检测法等。本文就乳品中兽药残留的种类和危害进行简单介绍，并重点总结了荧光免疫分析技术在乳品兽药残留检测中的应用。
1 乳品中兽药残留的危害
, 百拇医药
兽药残留是指动物产品中任何可食部分所含兽药的母体化合物及(或)其代谢物，以及与兽药有关的杂质。所以，兽药残留既包括原药，也包括药物在动物体内的代谢产物和兽药生产中所伴生的杂质。按照用途，可将残留毒理学意义较大的兽药分为7类，包括：抗生素类、驱肠虫药类、生长促进剂类、抗原虫药类、灭锥虫药类、镇静剂类、β-肾上腺素能受体阻断剂类，其中抗生素类是最主要的兽药添加剂，约占药物添加剂的60%。
人体长期摄入含兽药残留的乳品后会造成药物积累，产生耐药性和毒害作用，破坏胃肠道菌群环境。乳品中残留的许多低剂量抗菌药物如青霉素、四环素类、磺胺类和氨基糖苷类等可使部分人群发生过敏反应，甚至休克;硝基呋喃类、雌激素等都已经被证明具有致癌作用;苯丙咪唑类抗蠕虫药具有潜在的致突变性和致畸性;磺胺二甲嘧啶会诱发动物甲状腺增生，并有致肿瘤倾向。长期食用含以上药物残留的乳品后，均可能产生致畸、致癌和致突变等“三致”作用。另外，生长激素、性激素、甲状腺素类促生长激素以及人工合成的蛋白质同化激素等会干扰人体内的激素平衡，产生一系列激素样作用。动物养殖生产中滥用兽药、药物添加剂会导致动物的排泄物、动物产品加工的废弃物污染生态环境，影响人类健康。因此，乳品中兽药残留的快速检测受到越来越多的重视。
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2 荧光免疫分析技术
2.1 原理
1941年，Coons和Kaplan将荧光素和抗体结合来定位组织中的抗原，从而提出了荧光免疫分析法(fluorescent immunoassay， FIA)。该技术用已标记了荧光标记物的荧光抗体(抗原)作为探针，进而檢查组织或细胞内相应的抗原(抗体)，并在组织或细胞中所形成的抗原-抗体复合物上沉着有荧光标记物。在荧光显微镜下观察样品，荧光标记物受激发光的照射而发出荧光，因此可以根据荧光所在的细胞或组织，实现对抗原或抗体的定位，同时还可利用定量技术对样本进行定量。
2.2 荧光标记物
2.2.1 荧光素
荧光素是指具有荧光特性的有机染料，Coons等首次报道了异氰酸荧光素标记抗体用于检测鼠组织切片中肺炎球菌抗原分布的研究。此后，Riggs等合成了性质稳定、毒性较低的异硫氰酸荧光素;Marshall等改良了荧光抗体标记技术，使荧光免疫技术得到快速发展。目前，应用于荧光免疫分析的荧光素主要有5种——异硫氰酸荧光素、四乙烯基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、与酶作用后产生荧光的物质和镧系。
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2.2.2 半导体量子点
半导体量子点纳米晶，简称量子点(quantum dots， QDs)，直径通常在1～20nm之间，一般由II-VI或III-V族元素组成，具有激发谱宽、发射谱窄、荧光性强、不易淬灭、颜色可调等优点，是目前认为最具潜力的荧光探针之一。
2.2.3 稀土离子配合物
稀土离子配合物是指从元素镧到元素镥的15种元素的配合物，应用最广泛的主要是铕(Eu)和铽(Tb)。以钒酸盐(YVO4)为基质的纳米稀土发光材料是比较具有研究意义及应用价值的稀土荧光材料，由于其固态的微环境，掺杂矾酸盐的稀土离子配合物可增强其稳定性，避免了溶剂分子对荧光的淬灭，从而可发出高强度的特征荧光。随着纳米科学技术的发展，这一荧光材料有望成为新的免疫荧光标记体。
2.2.4 上转换纳米粒子
, 百拇医药
Auzel于1966年在研究NaYb(WO4)2钠玻璃时发现，如基质中含有Yb3+时，Er3+、Tm3+等，在近红外光激发下可以发射出可见光，由此提出了上转换发光的概念，即激发光的能量比发射光的能量低，称之为上转换发光。上转换发光大都发生在掺杂稀土离子的化合物中，NaYF4是目前上转换发光效率最高的基质材料。上转换纳米粒子与荧光染料、量子点相比具有毒性低、灵敏度高、稳定性好的优点，可避免样品中荧光特性基质对检测结果的影响，是目前理想的荧光标记物之一。
3 荧光免疫分析技术分类及其在乳品中兽药残留检测中的应用
3.1 荧光偏振免疫分析
荧光偏振免疫分析技术是以免疫竞争原理和荧光偏振原理为基础的一种快速筛选分析技术，主要用于测定小分子量物质(抗原)，即检测荧光标记抗原在结合特异性抗体前后的荧光偏振值变化，是均相的竞争免疫分析方法。这一反应系统完全在溶液中进行，不需要分离抗体，不易受到溶液颜色、仪器灵敏度的影响，具有操作简单和检测时间短等优点，适用于大量样本的快速筛选。
高月建立了用于检测牛奶中新霉素残留的荧光偏振检测方法，回收率高达87.91%～114.28%。宋佩等以异硫氰酸荧光素(FITC)作为荧光标记物标记沙拉沙星，利用薄层色谱法提纯，建立了沙拉沙星的快速荧光偏振免疫分析法。沙拉沙星在缓冲液中的半数抑制浓度(IC50)为43.2mg/L，检测范围为5.7～327mg/L，达到了国家规定的动物性食品中兽药最高残留限量(80mg/kg)的要求，与环丙沙星、恩诺沙星、加替沙星及氧氟沙星的交叉反应率分别为3.3%、1.8%、1.7%和0.7%，牛奶中沙拉沙星的回收率在71%～94%之间。该方法操作便捷、灵敏度高、特异性强，适用于动物性食品中沙拉沙星残留的快速筛选检测。, 百拇医药(方芳 郑君杰 孙志伟 李蓉蓉 刘薇 杨柳)
乳及乳制品作为一类营养全面的理想食品，能够为人体提供优质的蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素和无机盐等基本营养素。此外，乳制品在人类膳食结构中占有十分重要的地位，尤其是婴幼儿和老人。随着全球经济一体化和食品贸易国际化进程的加快，乳品的质量安全已成为世界性的挑战和全球关注的公共卫生问题。其中，兽药残留问题是影响乳制品安全的重要因素之一。目前，乳品中兽药残留的主要检测方法有微生物检测法、免疫分析法、仪器分析法、适配体传染器检测法等。本文就乳品中兽药残留的种类和危害进行简单介绍，并重点总结了荧光免疫分析技术在乳品兽药残留检测中的应用。
1 乳品中兽药残留的危害
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兽药残留是指动物产品中任何可食部分所含兽药的母体化合物及(或)其代谢物，以及与兽药有关的杂质。所以，兽药残留既包括原药，也包括药物在动物体内的代谢产物和兽药生产中所伴生的杂质。按照用途，可将残留毒理学意义较大的兽药分为7类，包括：抗生素类、驱肠虫药类、生长促进剂类、抗原虫药类、灭锥虫药类、镇静剂类、β-肾上腺素能受体阻断剂类，其中抗生素类是最主要的兽药添加剂，约占药物添加剂的60%。
人体长期摄入含兽药残留的乳品后会造成药物积累，产生耐药性和毒害作用，破坏胃肠道菌群环境。乳品中残留的许多低剂量抗菌药物如青霉素、四环素类、磺胺类和氨基糖苷类等可使部分人群发生过敏反应，甚至休克;硝基呋喃类、雌激素等都已经被证明具有致癌作用;苯丙咪唑类抗蠕虫药具有潜在的致突变性和致畸性;磺胺二甲嘧啶会诱发动物甲状腺增生，并有致肿瘤倾向。长期食用含以上药物残留的乳品后，均可能产生致畸、致癌和致突变等“三致”作用。另外，生长激素、性激素、甲状腺素类促生长激素以及人工合成的蛋白质同化激素等会干扰人体内的激素平衡，产生一系列激素样作用。动物养殖生产中滥用兽药、药物添加剂会导致动物的排泄物、动物产品加工的废弃物污染生态环境，影响人类健康。因此，乳品中兽药残留的快速检测受到越来越多的重视。
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2 荧光免疫分析技术
2.1 原理
1941年，Coons和Kaplan将荧光素和抗体结合来定位组织中的抗原，从而提出了荧光免疫分析法(fluorescent immunoassay， FIA)。该技术用已标记了荧光标记物的荧光抗体(抗原)作为探针，进而檢查组织或细胞内相应的抗原(抗体)，并在组织或细胞中所形成的抗原-抗体复合物上沉着有荧光标记物。在荧光显微镜下观察样品，荧光标记物受激发光的照射而发出荧光，因此可以根据荧光所在的细胞或组织，实现对抗原或抗体的定位，同时还可利用定量技术对样本进行定量。
2.2 荧光标记物
2.2.1 荧光素
荧光素是指具有荧光特性的有机染料，Coons等首次报道了异氰酸荧光素标记抗体用于检测鼠组织切片中肺炎球菌抗原分布的研究。此后，Riggs等合成了性质稳定、毒性较低的异硫氰酸荧光素;Marshall等改良了荧光抗体标记技术，使荧光免疫技术得到快速发展。目前，应用于荧光免疫分析的荧光素主要有5种——异硫氰酸荧光素、四乙烯基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、与酶作用后产生荧光的物质和镧系。
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2.2.2 半导体量子点
半导体量子点纳米晶，简称量子点(quantum dots， QDs)，直径通常在1～20nm之间，一般由II-VI或III-V族元素组成，具有激发谱宽、发射谱窄、荧光性强、不易淬灭、颜色可调等优点，是目前认为最具潜力的荧光探针之一。
2.2.3 稀土离子配合物
稀土离子配合物是指从元素镧到元素镥的15种元素的配合物，应用最广泛的主要是铕(Eu)和铽(Tb)。以钒酸盐(YVO4)为基质的纳米稀土发光材料是比较具有研究意义及应用价值的稀土荧光材料，由于其固态的微环境，掺杂矾酸盐的稀土离子配合物可增强其稳定性，避免了溶剂分子对荧光的淬灭，从而可发出高强度的特征荧光。随着纳米科学技术的发展，这一荧光材料有望成为新的免疫荧光标记体。
2.2.4 上转换纳米粒子
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Auzel于1966年在研究NaYb(WO4)2钠玻璃时发现，如基质中含有Yb3+时，Er3+、Tm3+等，在近红外光激发下可以发射出可见光，由此提出了上转换发光的概念，即激发光的能量比发射光的能量低，称之为上转换发光。上转换发光大都发生在掺杂稀土离子的化合物中，NaYF4是目前上转换发光效率最高的基质材料。上转换纳米粒子与荧光染料、量子点相比具有毒性低、灵敏度高、稳定性好的优点，可避免样品中荧光特性基质对检测结果的影响，是目前理想的荧光标记物之一。
3 荧光免疫分析技术分类及其在乳品中兽药残留检测中的应用
3.1 荧光偏振免疫分析
荧光偏振免疫分析技术是以免疫竞争原理和荧光偏振原理为基础的一种快速筛选分析技术，主要用于测定小分子量物质(抗原)，即检测荧光标记抗原在结合特异性抗体前后的荧光偏振值变化，是均相的竞争免疫分析方法。这一反应系统完全在溶液中进行，不需要分离抗体，不易受到溶液颜色、仪器灵敏度的影响，具有操作简单和检测时间短等优点，适用于大量样本的快速筛选。
高月建立了用于检测牛奶中新霉素残留的荧光偏振检测方法，回收率高达87.91%～114.28%。宋佩等以异硫氰酸荧光素(FITC)作为荧光标记物标记沙拉沙星，利用薄层色谱法提纯，建立了沙拉沙星的快速荧光偏振免疫分析法。沙拉沙星在缓冲液中的半数抑制浓度(IC50)为43.2mg/L，检测范围为5.7～327mg/L，达到了国家规定的动物性食品中兽药最高残留限量(80mg/kg)的要求，与环丙沙星、恩诺沙星、加替沙星及氧氟沙星的交叉反应率分别为3.3%、1.8%、1.7%和0.7%，牛奶中沙拉沙星的回收率在71%～94%之间。该方法操作便捷、灵敏度高、特异性强，适用于动物性食品中沙拉沙星残留的快速筛选检测。, 百拇医药(方芳 郑君杰 孙志伟 李蓉蓉 刘薇 杨柳)