四环素类药物时间分辨荧光层析检测试纸条的研制(1)
摘 要：本试验建立了一种检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析技术，并在动物源性食品中对其检测性能进行了研究。实验结果显示，对猪肉、鸡肉等动物组织样品中四环素类药物的检测限为：四环素30μg/kg、金霉素60μg/kg、土霉素40μg/kg、强力霉素80μg/kg;对100ppb的磺胺二甲基嘧啶、恩诺沙星、氯霉素等药物无交叉反应，特异性较好;变异系数小于6%，精密度高;试纸条对高、低温不敏感，稳定性强。
关键词：四环素类药物 时间分辨荧光免疫层析技术 快速检测
四环素类药物(TCs)主要由放线菌属产生，是氢化骈四苯环衍生物，具有广谱高效的杀菌抗生功效，对大部分的革兰氏阴性和阳性菌及少数酵母有抑制效果，可与大多数药物或饲料添加剂混用，现已被广泛应用于畜禽养殖生产中[1]。但是，四环素类药物在使用过程中存在着长期滥用的情况，残留在动物源性食品中的四环素类药物经过人们的饮食转移到人体内，其在体内的消化分解物会抑制蛋白质的合成而导致含氮代谢物增加，从而加大肾脏的工作负担，容易引起肾小管坏死，甚至会因肾功能衰竭而死亡[2]。同时，四环素类药物在人体内的累积容易引起恶心、呕吐、食道溃疡[3]、骨生长暂时性抑制及过敏反应，肝功能障碍者甚至会出现休克、尿毒症[4]等症状，严重威胁着人们的身体健康，为此世界各国对TCs残留的检测十分关注。我国规定，牛奶中土霉素、四环素、金霉素残留限量为100μg/L;欧盟第675/92号令中初步规定，在鸡肉及牛奶中的四环素类药物含量不得超过100μg/kg，在肾脏、肝脏及鸡蛋中的含量分别不得超过600μg/kg、300μg/kg、200μg/kg;日本《肯定列表制度》规定，奶和鸡蛋中四环素类化合物的总量分别不得超过100ng/mL和400ng/mg[5]。
, 百拇医药
现阶段，国内外主要利用高效液相色谱法、毛细管电泳法、微生物法、酶联免疫法、电化学分析等对四环素类药物进行定性和定量检测[6-13]。上述各种方法曾在不同时期得到广泛应用，也各自存在着不同于其他方法的优势与劣势。具体而言，色谱法需要价格昂贵的大型仪器设备，步骤繁琐、耗时且对操作人员的专业性要求较高，不适用于基层企事业单位的大通量快速筛查检测;酶联免疫试剂盒或胶体金快速检测试纸条具有检测速度快、价格便宜、操作简单等优点，但其准确性和重复性较差，基质效应明显，无法实现定量检测，且颜色单一，背景干扰大，容易造成假阳性或假阴性的结果。因此，亟需开发一种简单快速、准确度高的检测方法——时间分辨荧光免疫层析检测方法恰好可以满足此类需求。本实验研发了一种检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条，并在食源性动物食品的检测中进行了应用。
1 实验材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验耗材
, 百拇医药
PVC板，购于上海金标生物科技有限公司;时间分辨荧光微球，购于苏州为度生物技术有限公司;吸水垫、硝酸纤维素膜、样品垫，购于普利来基因技术公司;四环素类药物残留胶体金检测试纸条，北京勤邦生物技术有限公司自制。
1.1.2 试剂
四环素类药物、各種交叉反应药物、牛血清白蛋白、卵清蛋白，购自Sigma公司;分泌四环素类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株，北京勤邦生物技术有限公司制备;其他常规化学试剂均购自国药集团。
1.2 仪器与设备
时间分辨荧光免疫分析仪和旋涡混匀器，北京勤邦生物技术有限公司自有;Milli-Q Reference纯水仪，购自Millipore公司;2000SBL电子天平，购自美国setm公司;冷冻干燥机，购自Imagene公司。
1.3 试验方法
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1.3.1 荧光微球标记四环素类药物单克隆抗体的制备
取市售的内部包埋荧光染料、表面修饰有羧基官能团的微球悬液100μL混悬于900μL、pH5.5～6.5、0.05mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)活化缓冲液中，于4℃下10000r/min离心10min后弃上清，重悬微球于1mL活化缓冲液中，以此法洗涤微球2次，加入适量活化剂，混匀后室温震荡活化10min。将上述混悬液于4℃下10000r/min离心10min后弃上清，重悬于pH7.5～8.5、0.05mol/L的硼酸盐偶联缓冲液中，以此法洗涤微球2次，加入10～20μL四环素类药物单克隆抗体溶液(蛋白浓度为1mg/mL)，混匀后室温震荡偶联120min。获得混悬液于4℃下10000r/min离心10min后弃上清，重悬于0.1～0.4mol/L伯胺(盐酸羟胺、乙醇胺或氨基乙醇)、1%～10%BSA且pH7.4的PB封闭缓冲液中，以此法洗涤微球1次，混匀后室温震荡封闭30min，然后于4℃下10000r/min离心10min后弃上清，重悬于0.01%NaN3、0.1%BSA且pH7.4的PB贮存缓冲液中，以此法洗涤微球1次，混匀后于4℃避光保存。
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1.3.2 试纸条的制备
①硝酸纤维素(NC)膜的制备
用0.05mol/L、pH7.2的PBS缓冲液将四环素类药物半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到100μg/mL，用Isoflow点膜仪将其喷涂于NC膜上的检测区(T)，喷膜量为1.0μL/cm。用0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液将羊抗鼠抗体稀释到200μg/mL，用Isoflow点膜仪将其喷涂于NC膜上的质控区(C)，喷膜量为1.0μL/cm。将制备好的NC膜置于37℃条件下干燥2h，备用。
②样品吸收垫的制备
将样品吸收垫用含0.5%牛血清白蛋白(体积分数)、pH7.2、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液浸泡2h，置于37℃下烘干2h，备用。
③试纸条的组装
将样品吸收垫、硝酸纤维素膜、吸水垫从左至右依次搭接粘贴固定在底板上，样品吸收垫的末端与硝酸纤维素膜的始端相连，硝酸纤维素膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，然后用机器切成宽3.96mm的小条，装在特制的塑料制卡中，形成试纸卡。, http://www.100md.com(万宇平 崔海峰 王兆芹 宋灏 丛倩千)
关键词：四环素类药物 时间分辨荧光免疫层析技术 快速检测
四环素类药物(TCs)主要由放线菌属产生，是氢化骈四苯环衍生物，具有广谱高效的杀菌抗生功效，对大部分的革兰氏阴性和阳性菌及少数酵母有抑制效果，可与大多数药物或饲料添加剂混用，现已被广泛应用于畜禽养殖生产中[1]。但是，四环素类药物在使用过程中存在着长期滥用的情况，残留在动物源性食品中的四环素类药物经过人们的饮食转移到人体内，其在体内的消化分解物会抑制蛋白质的合成而导致含氮代谢物增加，从而加大肾脏的工作负担，容易引起肾小管坏死，甚至会因肾功能衰竭而死亡[2]。同时，四环素类药物在人体内的累积容易引起恶心、呕吐、食道溃疡[3]、骨生长暂时性抑制及过敏反应，肝功能障碍者甚至会出现休克、尿毒症[4]等症状，严重威胁着人们的身体健康，为此世界各国对TCs残留的检测十分关注。我国规定，牛奶中土霉素、四环素、金霉素残留限量为100μg/L;欧盟第675/92号令中初步规定，在鸡肉及牛奶中的四环素类药物含量不得超过100μg/kg，在肾脏、肝脏及鸡蛋中的含量分别不得超过600μg/kg、300μg/kg、200μg/kg;日本《肯定列表制度》规定，奶和鸡蛋中四环素类化合物的总量分别不得超过100ng/mL和400ng/mg[5]。
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现阶段，国内外主要利用高效液相色谱法、毛细管电泳法、微生物法、酶联免疫法、电化学分析等对四环素类药物进行定性和定量检测[6-13]。上述各种方法曾在不同时期得到广泛应用，也各自存在着不同于其他方法的优势与劣势。具体而言，色谱法需要价格昂贵的大型仪器设备，步骤繁琐、耗时且对操作人员的专业性要求较高，不适用于基层企事业单位的大通量快速筛查检测;酶联免疫试剂盒或胶体金快速检测试纸条具有检测速度快、价格便宜、操作简单等优点，但其准确性和重复性较差，基质效应明显，无法实现定量检测，且颜色单一，背景干扰大，容易造成假阳性或假阴性的结果。因此，亟需开发一种简单快速、准确度高的检测方法——时间分辨荧光免疫层析检测方法恰好可以满足此类需求。本实验研发了一种检测四环素类药物的时间分辨荧光免疫层析试纸条，并在食源性动物食品的检测中进行了应用。
1 实验材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验耗材
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PVC板，购于上海金标生物科技有限公司;时间分辨荧光微球，购于苏州为度生物技术有限公司;吸水垫、硝酸纤维素膜、样品垫，购于普利来基因技术公司;四环素类药物残留胶体金检测试纸条，北京勤邦生物技术有限公司自制。
1.1.2 试剂
四环素类药物、各種交叉反应药物、牛血清白蛋白、卵清蛋白，购自Sigma公司;分泌四环素类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株，北京勤邦生物技术有限公司制备;其他常规化学试剂均购自国药集团。
1.2 仪器与设备
时间分辨荧光免疫分析仪和旋涡混匀器，北京勤邦生物技术有限公司自有;Milli-Q Reference纯水仪，购自Millipore公司;2000SBL电子天平，购自美国setm公司;冷冻干燥机，购自Imagene公司。
1.3 试验方法
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1.3.1 荧光微球标记四环素类药物单克隆抗体的制备
取市售的内部包埋荧光染料、表面修饰有羧基官能团的微球悬液100μL混悬于900μL、pH5.5～6.5、0.05mol/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)活化缓冲液中，于4℃下10000r/min离心10min后弃上清，重悬微球于1mL活化缓冲液中，以此法洗涤微球2次，加入适量活化剂，混匀后室温震荡活化10min。将上述混悬液于4℃下10000r/min离心10min后弃上清，重悬于pH7.5～8.5、0.05mol/L的硼酸盐偶联缓冲液中，以此法洗涤微球2次，加入10～20μL四环素类药物单克隆抗体溶液(蛋白浓度为1mg/mL)，混匀后室温震荡偶联120min。获得混悬液于4℃下10000r/min离心10min后弃上清，重悬于0.1～0.4mol/L伯胺(盐酸羟胺、乙醇胺或氨基乙醇)、1%～10%BSA且pH7.4的PB封闭缓冲液中，以此法洗涤微球1次，混匀后室温震荡封闭30min，然后于4℃下10000r/min离心10min后弃上清，重悬于0.01%NaN3、0.1%BSA且pH7.4的PB贮存缓冲液中，以此法洗涤微球1次，混匀后于4℃避光保存。
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1.3.2 试纸条的制备
①硝酸纤维素(NC)膜的制备
用0.05mol/L、pH7.2的PBS缓冲液将四环素类药物半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到100μg/mL，用Isoflow点膜仪将其喷涂于NC膜上的检测区(T)，喷膜量为1.0μL/cm。用0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲液将羊抗鼠抗体稀释到200μg/mL，用Isoflow点膜仪将其喷涂于NC膜上的质控区(C)，喷膜量为1.0μL/cm。将制备好的NC膜置于37℃条件下干燥2h，备用。
②样品吸收垫的制备
将样品吸收垫用含0.5%牛血清白蛋白(体积分数)、pH7.2、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液浸泡2h，置于37℃下烘干2h，备用。
③试纸条的组装
将样品吸收垫、硝酸纤维素膜、吸水垫从左至右依次搭接粘贴固定在底板上，样品吸收垫的末端与硝酸纤维素膜的始端相连，硝酸纤维素膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，然后用机器切成宽3.96mm的小条，装在特制的塑料制卡中，形成试纸卡。, http://www.100md.com(万宇平 崔海峰 王兆芹 宋灏 丛倩千)