金黄色葡萄球菌生物传感检测方法研究
摘 要：本文的目的是建立一种运用电化学免疫传感器快速检测金黄色葡萄球菌的方法。该传感器采用微间隙阵列电极作为基础电极，运用双抗夹心酶联免疫反应和酶催化银沉积反应实现分析信号放大。该方法特异性良好，对非目标菌株无交叉反应，检出限为104CFU/mL，线性范围为104～108CFU/mL，传感器的电导率与金黄色葡萄球菌浓度之间的线性关系较好，线性相关系数R2=0.947。本研究证明，电化学免疫传感器快速检测金黄色葡萄球菌法具有检测速度快、操作简便、检测成本低等优点，为金黄色葡萄球菌的快速检测工作提供了一种有效手段。
关键词：微间隙阵列电极传感器 金黄色葡萄球菌 酶催化银沉淀
金黄色葡萄球菌是革兰式阳性球菌中最为常见的一种，其广泛存在于自然界，可引起食物中毒、脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎等疾病[1]。金黄色葡萄球菌是细菌性食物中毒事件的主要诱发因子[2]，因此准确快速地检测金黄色葡萄球菌对食品安全检测工作来说非常重要。目前，针对金黄色葡萄球菌的标准检测方法主要是微生物培养法，但需要增菌、分离、生化鉴定等步骤，检测时间通常在4天以上[3]。该方法基于致病菌的生长代谢，操作复杂且检测周期较长，无法满足现场快速、准确检测的要求。本研究拟运用金黄色葡萄球菌特异性单、多克隆抗体，在微间隙阵列电极上包被多克隆抗体用于捕获目标物，当目标物存在时，单克隆抗体特异性识别目标物就会形成三明治结构的免疫复合物，体系中的碱性磷酸酶可将银离子还原，而形成的银单质沉淀在电极表面及其间隙中。与此同时，电极间的电导率与银单质的沉淀量呈线性关系，可实现目标物的定量分析[4]。本方法具有精准快速、操作简便的优点，可用于金黄色葡萄球菌及其它食源性致病菌的快速检测。
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1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、沙门氏菌[CMCC(B)50115]、大肠杆菌O157：H7(ATCC 43889)、副溶血性弧菌(ATCC 17802)、阪崎肠杆菌(CICC 21561)、蜡样芽胞杆菌[CMCC(B)63303]、单核细胞增生李斯特氏菌(ATCC 19115)、铜绿假单胞菌(ATCC 27853)，以上菌株均购买自相应的菌种保藏中心。
抗金黄色葡萄球菌多克隆抗体、单克隆抗体，购自上海慧耘生物科技有限公司；碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AP)标记的山羊抗鼠IgG、抗坏血酸磷酸酯(ascorbic acid 2-phosphatase，AAP)，购自sigma公司；AgNO3、甘氨酸，购自国药集团化学试剂有限公司。
主要仪器：CHI760D电化学工作站，上海辰华仪器公司；LRH-250F数显恒温器，上海一恒科技有限公司；微间隙阵列电极传感器件，实验室设计[4]。
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1.2 菌液准备
菌种活化后，菌液用麦氏比浊管测定其浓度，灭活后用生理盐水稀释制备成不同浓度的菌悬液。
1.3 试验方法
微间隙阵列电极用无水乙醇和超纯水清洗后晾干；工作芯片用5μg/mL金黄色葡萄球菌多克隆抗体包被；加入1%脱脂奶粉溶液200μL，在37℃恒温孵育1h，封闭芯片表面未结合抗体的位点；加入灭活菌液100μL，37℃孵育1h；加入5μg/mL金黄色葡萄球菌单克隆抗体100μL，37℃孵育30min；加入AP标记的山羊抗鼠IgG 100μL，37℃孵育30min；加入含1mmol/L AAP和5mmol/L AgNO3的底物溶液100μL，37℃避光孵育10min，用超纯水清洗3次，晾干后待测。
将微间隙阵列电极传感器的电极与电化学工作站的工作电极连接，采用线性扫描伏安法在0～50mV点位范围检测。
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1.4 特异性分析
以金黄色葡萄球菌为阳性对照，以沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7等標准菌株作为特异性检测菌株，以PSBT做空白对照，从而验证方法的特异性。
1.5 灵敏度分析
将金黄色葡萄球菌灭活菌液稀释为1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108CFU/mL等5个浓度梯度，以PBST作为阴性对照，通过检测电导信号确定方法的检测灵敏度。
2 结果与分析
2.1 检测方法特异性
使用微间隙阵列电极传感器检测了8种致病菌，以测试该方法的特异性，不同菌种检测的电导值变化见图1。由图1可见，只有加入金黄色葡萄球菌悬液的传感器电导率变化明显，空白对照和非目标菌株的电导率变化不明显，说明该方法对金黄色葡萄球菌的特异性较高，且与其他菌株无交叉反应。
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2.2 检测方法灵敏度
金黄色葡萄球菌浓度在104～108CFU/mL范围内变化时，其LSV响应曲线见图2。由图2可知，菌液浓度越高，其电导值越大，该方法的检测限为104CFU/mL。同时，金黄色葡萄球菌浓度越高，检测到的电导率越大，二者之间呈线性关系(如图3)，其线性方程为：电导率(pS)=1169LogC(CFU·mL-1)-1141，R2=0.947。
3 结论
本文采用微间隙阵列电极作为基础电极，结合双抗夹心免疫反应构建了电化学免疫传感器，通过电化学分析，实现了对金黄色葡萄球菌的检测。实验结果显示，该方法特异性良好，检测灵敏度可达104CFU/mL，检测电导率和菌浓度呈正相关，线性相关系数为0.947。本方法利用碱性磷酸酶的催化作用，使银离子还原成银单质沉淀在电极之间，相邻的电极被导通从而在有外加电压时产生电流信号，电化学信号放大系统具有灵敏度高、高效、背景干扰低等优点。免疫反应采用双抗夹心法，包被抗体为多克隆抗体，能有效捕获目标菌株，识别抗体为单克隆抗体，有效提高了该方法的特异性。该方法将电化学生物传感技术与免疫学方法有效结合，可以将封闭好的芯片真空干燥后密闭保存，现场试验只需加增菌液的后续步骤，从而缩短了检测时间，可以满足现场检测的需要。
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参考文献：
[1] Ding Tian， Shim Young-Hwan， Choi Na-Jung， et al. Mathematical modeling on the growth of Staphylococcus aureus in sandwich. Food Sci Biotechnol， 2010，19(3)：763-768.
[2] Argudín M–， Mendoza MC， Rodicio MR. Food poisoning and Staphylococcus aureus enterotoxins. Toxins 2010，2： 1751–1773.
[3] Murakami T. Filter-based pathogen enrichment technology for detection of multiple viable foodborne pathogens in 1 day. J Food Prot， 2012，75：1603–1610.
[4] 杨丽霞，邱华丽，周金沙等.基于微间隙阵列电极传感器检测副溶血性弧菌的方法初探.食品安全质量检测学报.2017，8(8)：3151-3155.
基金项目：国家公益性行业科研专项项目(编号：201310130)；长沙市科技计划项目(kq1801151)。, http://www.100md.com
关键词：微间隙阵列电极传感器 金黄色葡萄球菌 酶催化银沉淀
金黄色葡萄球菌是革兰式阳性球菌中最为常见的一种，其广泛存在于自然界，可引起食物中毒、脑膜炎、骨髓炎、心内膜炎等疾病[1]。金黄色葡萄球菌是细菌性食物中毒事件的主要诱发因子[2]，因此准确快速地检测金黄色葡萄球菌对食品安全检测工作来说非常重要。目前，针对金黄色葡萄球菌的标准检测方法主要是微生物培养法，但需要增菌、分离、生化鉴定等步骤，检测时间通常在4天以上[3]。该方法基于致病菌的生长代谢，操作复杂且检测周期较长，无法满足现场快速、准确检测的要求。本研究拟运用金黄色葡萄球菌特异性单、多克隆抗体，在微间隙阵列电极上包被多克隆抗体用于捕获目标物，当目标物存在时，单克隆抗体特异性识别目标物就会形成三明治结构的免疫复合物，体系中的碱性磷酸酶可将银离子还原，而形成的银单质沉淀在电极表面及其间隙中。与此同时，电极间的电导率与银单质的沉淀量呈线性关系，可实现目标物的定量分析[4]。本方法具有精准快速、操作简便的优点，可用于金黄色葡萄球菌及其它食源性致病菌的快速检测。
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1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、沙门氏菌[CMCC(B)50115]、大肠杆菌O157：H7(ATCC 43889)、副溶血性弧菌(ATCC 17802)、阪崎肠杆菌(CICC 21561)、蜡样芽胞杆菌[CMCC(B)63303]、单核细胞增生李斯特氏菌(ATCC 19115)、铜绿假单胞菌(ATCC 27853)，以上菌株均购买自相应的菌种保藏中心。
抗金黄色葡萄球菌多克隆抗体、单克隆抗体，购自上海慧耘生物科技有限公司；碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AP)标记的山羊抗鼠IgG、抗坏血酸磷酸酯(ascorbic acid 2-phosphatase，AAP)，购自sigma公司；AgNO3、甘氨酸，购自国药集团化学试剂有限公司。
主要仪器：CHI760D电化学工作站，上海辰华仪器公司；LRH-250F数显恒温器，上海一恒科技有限公司；微间隙阵列电极传感器件，实验室设计[4]。
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1.2 菌液准备
菌种活化后，菌液用麦氏比浊管测定其浓度，灭活后用生理盐水稀释制备成不同浓度的菌悬液。
1.3 试验方法
微间隙阵列电极用无水乙醇和超纯水清洗后晾干；工作芯片用5μg/mL金黄色葡萄球菌多克隆抗体包被；加入1%脱脂奶粉溶液200μL，在37℃恒温孵育1h，封闭芯片表面未结合抗体的位点；加入灭活菌液100μL，37℃孵育1h；加入5μg/mL金黄色葡萄球菌单克隆抗体100μL，37℃孵育30min；加入AP标记的山羊抗鼠IgG 100μL，37℃孵育30min；加入含1mmol/L AAP和5mmol/L AgNO3的底物溶液100μL，37℃避光孵育10min，用超纯水清洗3次，晾干后待测。
将微间隙阵列电极传感器的电极与电化学工作站的工作电极连接，采用线性扫描伏安法在0～50mV点位范围检测。
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1.4 特异性分析
以金黄色葡萄球菌为阳性对照，以沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7等標准菌株作为特异性检测菌株，以PSBT做空白对照，从而验证方法的特异性。
1.5 灵敏度分析
将金黄色葡萄球菌灭活菌液稀释为1.0×104、1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108CFU/mL等5个浓度梯度，以PBST作为阴性对照，通过检测电导信号确定方法的检测灵敏度。
2 结果与分析
2.1 检测方法特异性
使用微间隙阵列电极传感器检测了8种致病菌，以测试该方法的特异性，不同菌种检测的电导值变化见图1。由图1可见，只有加入金黄色葡萄球菌悬液的传感器电导率变化明显，空白对照和非目标菌株的电导率变化不明显，说明该方法对金黄色葡萄球菌的特异性较高，且与其他菌株无交叉反应。
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2.2 检测方法灵敏度
金黄色葡萄球菌浓度在104～108CFU/mL范围内变化时，其LSV响应曲线见图2。由图2可知，菌液浓度越高，其电导值越大，该方法的检测限为104CFU/mL。同时，金黄色葡萄球菌浓度越高，检测到的电导率越大，二者之间呈线性关系(如图3)，其线性方程为：电导率(pS)=1169LogC(CFU·mL-1)-1141，R2=0.947。
3 结论
本文采用微间隙阵列电极作为基础电极，结合双抗夹心免疫反应构建了电化学免疫传感器，通过电化学分析，实现了对金黄色葡萄球菌的检测。实验结果显示，该方法特异性良好，检测灵敏度可达104CFU/mL，检测电导率和菌浓度呈正相关，线性相关系数为0.947。本方法利用碱性磷酸酶的催化作用，使银离子还原成银单质沉淀在电极之间，相邻的电极被导通从而在有外加电压时产生电流信号，电化学信号放大系统具有灵敏度高、高效、背景干扰低等优点。免疫反应采用双抗夹心法，包被抗体为多克隆抗体，能有效捕获目标菌株，识别抗体为单克隆抗体，有效提高了该方法的特异性。该方法将电化学生物传感技术与免疫学方法有效结合，可以将封闭好的芯片真空干燥后密闭保存，现场试验只需加增菌液的后续步骤，从而缩短了检测时间，可以满足现场检测的需要。
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参考文献：
[1] Ding Tian， Shim Young-Hwan， Choi Na-Jung， et al. Mathematical modeling on the growth of Staphylococcus aureus in sandwich. Food Sci Biotechnol， 2010，19(3)：763-768.
[2] Argudín M–， Mendoza MC， Rodicio MR. Food poisoning and Staphylococcus aureus enterotoxins. Toxins 2010，2： 1751–1773.
[3] Murakami T. Filter-based pathogen enrichment technology for detection of multiple viable foodborne pathogens in 1 day. J Food Prot， 2012，75：1603–1610.
[4] 杨丽霞，邱华丽，周金沙等.基于微间隙阵列电极传感器检测副溶血性弧菌的方法初探.食品安全质量检测学报.2017，8(8)：3151-3155.
基金项目：国家公益性行业科研专项项目(编号：201310130)；长沙市科技计划项目(kq1801151)。, http://www.100md.com