液相色谱串联质谱法检测鸡蛋中磺胺类药物
磺胺类药物(SAs)是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类化学药物的总称，被广泛用于畜禽生产中以防治细菌感染。在养殖密度较大的家禽行业中，使用磺胺类药物防治细菌感染的做法尤为普遍，因此禽蛋中存在着磺胺类药物残留的风险。
目前，我国相关的动物源性食品中磺胺类药物的检测方法已有相关标准，但对鸡蛋中仪器检测的报道文献较少。本文建立了鸡蛋中16种磺胺类药物的超高效液相色谱串联质谱检测方法，其灵敏度高、稳定性好，能够满足对鸡蛋中磺胺类药物残留的检测要求。
1 实验部分
1.1 试剂与耗材
磺胺乙酰、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二恶唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲恶唑、磺胺吡啶、磺胺地索辛、磺胺甲氧哒嗪、磺胺二甲基异噁唑、苯甲酰磺胺、磺胺喹恶啉、磺胺邻苯甲氧嘧啶，德国DR.E公司。
, http://www.100md.com
乙腈、甲醇、甲酸等，均为色谱纯(国药)。
将标准品用甲醇配制成单标母液，并配制10μg/mL混合储备液于-20℃保存，使用时现配为系列标准工作液。
鸡蛋购于超市，经液质分析确认均为阴性样本。
1.2 仪器设备
ACQUITYTM型超高效液相色谱仪、Waters Xevo TQS四极杆质谱仪(配电喷雾离子源)、ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)，美国Waters公司；离心机；纯水仪；氮吹仪。
1.3 试验
, 百拇医药 1.3.1 前处理方法优化
本实验比较了乙腈、1%甲酸乙腈作为提取溶剂，对事先添加25μg/kg混标溶液的空白鸡蛋样本进行提取，并进行提取溶剂优化试验；比较了涡旋振荡提取、涡旋振荡+超声配合提取，对事先添加25μg/kg混标溶液的空白鸡蛋样本进行萃取，同时进行提取方法优化试验；比较了10g无水硫酸钠加入与否对结果的影响；最终确定最优的前处理条件。
1.3.2 优化后的前处理方法
称取样品2g，加入混合内标工作液100ng、无水硫酸钠10g、12mL1%甲酸乙腈，涡旋振荡2min，超声提取10min；7000rpm离心5min，取上清，60℃水浴氮吹至干。然后，加入5mL正己烷进行净化，并加入2mL初始流动相进行复溶，弃去上层液体，取下层溶液0.22μm滤膜待上机测定。
1.3.3 液相条件
, 百拇医药
色谱柱：A cquity UPLC BEH C18(100mm×2.1mm，1.7μm)；流动相A：2mmol乙酸铵-0.1%甲酸；流动相B：乙腈。
1.3.4 质谱条件
电离子模式：ES+；毛细管电压：1.2kV；萃取锥孔电压：60V；RF透镜电压：50V；离子源温：600℃；脱溶剂温度：600℃；锥孔气流速：150L/h；脱溶剂气流速：1000L/h；碰撞气流速：0.15mL/min；采集模式：MRM；各种药物优化母离子和子离子及对应聚焦电压和碰撞电压值见表2。
1.3.5 定量测定
按照仪器的色谱条件和质谱条件，将混合标准工作液及样品液等体积进样测定，磺胺二甲异恶唑、磺胺喹恶啉和磺胺间二甲氧嘧啶以氘代磺胺间二甲氧嘧啶为内标；磺胺二甲异嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺间甲氧嗜啶、磺胺甲氧哒嗪、碳胺甲恶唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、碳胺甲基嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶和磺胺氯哒嗪以氘代磺胺邻二甲氧嘧啶为内标；磺胺氯吡嗪采用外标法定量。
, 百拇医药
1.3.6 方法线性和灵敏度试验
试验采用空白鸡蛋样品，经1.3.2方法处理，在1.0～50μg/kg浓度范围内分别添加不同梯度磺胺类药物混标溶液，分别配制1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0μg/kg基质加标溶液，通过检测峰面积绘制峰面积-浓度标准曲线，同时将处理好的空白鸡蛋样品逐级稀释至标准溶液。
1.3.7 方法的回收率试验
试验选取空白鸡蛋样品，分别添加浓度为2.0、10.0、25.0μg/kg低、中、高3个水平混标溶液，每个浓度做6个平行，按照1.2.2方法进行添加回收试验，通过测定回收率和RSD来评估方法的准确度和精密度。
2 结果与讨论
, 百拇医药
2.1 提取溶剂的选择
结果表明，以1%甲酸乙腈为提取液时，除了磺胺氯吡嗪外的其他15种磺胺类药物的回收率与乙腈作为提取剂的回收率均有所提高，结果见图1。
2.2 提取方法的选择
试验结果表明，将涡旋振荡提取与超声提取结合的提取方法，其回收率明显优于单纯的涡旋振荡提取法，结果见图2。
2.3 净化剂对结果的影响
试验结果表明，加入净化剂后，提取液外观更为澄清，回收率更好，结果见图3。试验最终选择10g无水硫酸钠作为净化剂。
2.4 线性方程及灵敏度试验
, 百拇医药
结果表明，1.0～50μg/kg范围内线性关系良好，相关系数均大于0.99；将处理好的空白鸡蛋样品逐级稀释标准溶液，按照10倍信噪比确定方法的LOQ；为了便于配置混标溶液且在满足检测要求的前提下，将16种药物的定量限定于2.0μg/kg，结果见表3。
2.5 回收率和精密度试验
从表4可以看出，16种磺胺类药物的回收率在75.53%～125.23%，RSD在0.08%～14.98%，说明本方法准确度、精密度均能满足鸡蛋中磺胺类药物的检测要求。
3 结论
检测准确性是对仪器检测方法的第一需求，而前处理方法是仪器检测方法中较为复杂且非常重要的环节。本文通过对提取剂、提取方法、净化与否的优化，建立了同时检测鸡蛋中16种磺胺UPLC-MS-MS的检测方法。
本方法的样品经过振荡和超声混合提取、加入净化剂净化，提取率高、净化效果好，并以超高效液相色谱串联质谱进行检测。该方法灵敏度高、稳定性好、回收率均保持在比较满意的水平，能够满足同时检测鸡蛋中多种磺胺类藥物残留的要求，为制定禽蛋中磺胺类药物检测标准提供了技术参考。
, 百拇医药(伦丽丽)
目前，我国相关的动物源性食品中磺胺类药物的检测方法已有相关标准，但对鸡蛋中仪器检测的报道文献较少。本文建立了鸡蛋中16种磺胺类药物的超高效液相色谱串联质谱检测方法，其灵敏度高、稳定性好，能够满足对鸡蛋中磺胺类药物残留的检测要求。
1 实验部分
1.1 试剂与耗材
磺胺乙酰、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二恶唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺甲恶唑、磺胺吡啶、磺胺地索辛、磺胺甲氧哒嗪、磺胺二甲基异噁唑、苯甲酰磺胺、磺胺喹恶啉、磺胺邻苯甲氧嘧啶，德国DR.E公司。
, http://www.100md.com
乙腈、甲醇、甲酸等，均为色谱纯(国药)。
将标准品用甲醇配制成单标母液，并配制10μg/mL混合储备液于-20℃保存，使用时现配为系列标准工作液。
鸡蛋购于超市，经液质分析确认均为阴性样本。
1.2 仪器设备
ACQUITYTM型超高效液相色谱仪、Waters Xevo TQS四极杆质谱仪(配电喷雾离子源)、ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)，美国Waters公司；离心机；纯水仪；氮吹仪。
1.3 试验
, 百拇医药 1.3.1 前处理方法优化
本实验比较了乙腈、1%甲酸乙腈作为提取溶剂，对事先添加25μg/kg混标溶液的空白鸡蛋样本进行提取，并进行提取溶剂优化试验；比较了涡旋振荡提取、涡旋振荡+超声配合提取，对事先添加25μg/kg混标溶液的空白鸡蛋样本进行萃取，同时进行提取方法优化试验；比较了10g无水硫酸钠加入与否对结果的影响；最终确定最优的前处理条件。
1.3.2 优化后的前处理方法
称取样品2g，加入混合内标工作液100ng、无水硫酸钠10g、12mL1%甲酸乙腈，涡旋振荡2min，超声提取10min；7000rpm离心5min，取上清，60℃水浴氮吹至干。然后，加入5mL正己烷进行净化，并加入2mL初始流动相进行复溶，弃去上层液体，取下层溶液0.22μm滤膜待上机测定。
1.3.3 液相条件
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色谱柱：A cquity UPLC BEH C18(100mm×2.1mm，1.7μm)；流动相A：2mmol乙酸铵-0.1%甲酸；流动相B：乙腈。
1.3.4 质谱条件
电离子模式：ES+；毛细管电压：1.2kV；萃取锥孔电压：60V；RF透镜电压：50V；离子源温：600℃；脱溶剂温度：600℃；锥孔气流速：150L/h；脱溶剂气流速：1000L/h；碰撞气流速：0.15mL/min；采集模式：MRM；各种药物优化母离子和子离子及对应聚焦电压和碰撞电压值见表2。
1.3.5 定量测定
按照仪器的色谱条件和质谱条件，将混合标准工作液及样品液等体积进样测定，磺胺二甲异恶唑、磺胺喹恶啉和磺胺间二甲氧嘧啶以氘代磺胺间二甲氧嘧啶为内标；磺胺二甲异嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺间甲氧嗜啶、磺胺甲氧哒嗪、碳胺甲恶唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、碳胺甲基嘧啶、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶和磺胺氯哒嗪以氘代磺胺邻二甲氧嘧啶为内标；磺胺氯吡嗪采用外标法定量。
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1.3.6 方法线性和灵敏度试验
试验采用空白鸡蛋样品，经1.3.2方法处理，在1.0～50μg/kg浓度范围内分别添加不同梯度磺胺类药物混标溶液，分别配制1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0μg/kg基质加标溶液，通过检测峰面积绘制峰面积-浓度标准曲线，同时将处理好的空白鸡蛋样品逐级稀释至标准溶液。
1.3.7 方法的回收率试验
试验选取空白鸡蛋样品，分别添加浓度为2.0、10.0、25.0μg/kg低、中、高3个水平混标溶液，每个浓度做6个平行，按照1.2.2方法进行添加回收试验，通过测定回收率和RSD来评估方法的准确度和精密度。
2 结果与讨论
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2.1 提取溶剂的选择
结果表明，以1%甲酸乙腈为提取液时，除了磺胺氯吡嗪外的其他15种磺胺类药物的回收率与乙腈作为提取剂的回收率均有所提高，结果见图1。
2.2 提取方法的选择
试验结果表明，将涡旋振荡提取与超声提取结合的提取方法，其回收率明显优于单纯的涡旋振荡提取法，结果见图2。
2.3 净化剂对结果的影响
试验结果表明，加入净化剂后，提取液外观更为澄清，回收率更好，结果见图3。试验最终选择10g无水硫酸钠作为净化剂。
2.4 线性方程及灵敏度试验
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结果表明，1.0～50μg/kg范围内线性关系良好，相关系数均大于0.99；将处理好的空白鸡蛋样品逐级稀释标准溶液，按照10倍信噪比确定方法的LOQ；为了便于配置混标溶液且在满足检测要求的前提下，将16种药物的定量限定于2.0μg/kg，结果见表3。
2.5 回收率和精密度试验
从表4可以看出，16种磺胺类药物的回收率在75.53%～125.23%，RSD在0.08%～14.98%，说明本方法准确度、精密度均能满足鸡蛋中磺胺类药物的检测要求。
3 结论
检测准确性是对仪器检测方法的第一需求，而前处理方法是仪器检测方法中较为复杂且非常重要的环节。本文通过对提取剂、提取方法、净化与否的优化，建立了同时检测鸡蛋中16种磺胺UPLC-MS-MS的检测方法。
本方法的样品经过振荡和超声混合提取、加入净化剂净化，提取率高、净化效果好，并以超高效液相色谱串联质谱进行检测。该方法灵敏度高、稳定性好、回收率均保持在比较满意的水平，能够满足同时检测鸡蛋中多种磺胺类藥物残留的要求，为制定禽蛋中磺胺类药物检测标准提供了技术参考。
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