桂柳姿，崔培梧，潘清平，唐金凤，鲁耀邦

    (1.湖南中医药大学，湖南 长沙410208；2.湖南省中药现代化研究重点实验室，湖南 长沙410208；3.广东医学院，广东；4.中药药性与药效三级科研实验室，湖南 长沙410208)

    忽地笑(Lycoris aurea)，又名黄花石蒜，是石蒜科(Amaryllidaceae)石蒜属(Lycoris Herb.)多年生草本植物，其在生长繁殖过程中会产生多种生物碱，其中加兰他敏(Galanthamine)是一种苄基乙胺类生物碱[1]，属乙酰胆碱酯酶抑制剂[2]，为治疗阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s Disease，AD)的首选药物之一。由于化学合成加兰他敏成本高昂，目前药用加兰他敏主要从石蒜科植物的鳞茎中提取分离得到[3]。在本课题组的前期研究中，比较了黄花石蒜花蕊和花葶组织中总RNA 的提取方法[4]，以及使用以RNA 差异显示法筛选黄花石蒜中加兰他敏合成相关基因[5]。

    目前认为加兰他敏在植物体内的生物合成途径主要分为六个步骤，首先是原儿茶醛与酪胺(tyramine)合成降孤挺花啶(norbelladine)，然后降孤挺花啶在儿茶酚氧位甲基转移酶 (catechol-O-methytransferase，COMT)的催化下接受一个甲基基团转变为4-氧-甲基降孤挺花啶，而4-氧-甲基降孤挺花啶是加兰他敏、文殊兰胺(crinine)、石蒜碱(lycorine)等石蒜科生物碱的共同前体[3]。COMT 是一种S-腺苷-L-甲硫胺酸(SAM)依赖的甲基转移酶，目前在烟草(Nicotiana tabacum)[6]、罂粟(Papaver somniferum)、唐松草(Thalictrum tuberosum)[7]和玉米(Zea mays)[8]等多种植物中被克隆。而本实验首次从忽地笑克隆COMT 酶基因并对其编码的蛋白质进行了生物信息学分析。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 实验材料 忽地笑花瓣于2012年7月10日采自湖南衡山，经湖南中医药大学中药鉴定学教研室潘清平教授鉴定后于-80 ℃保存。

    1.1.2 主要试剂 RNAprep pure 植物总RNA 提取试剂盒(TIANGEN，北京)，SuperScriptTMIII Firststrand Synthesis System (Invitrogen，美国)、3’Full RACE Core set Ver.2.0、5’ Full RACE kit、pMD19-T Vector、Primer STARRHS DNA Polymerase、LA Taq、A-Tailing 试剂盒、Eoli.DH5α 感受态细胞(大连宝生物公司) ......