附子-甘草对离体蛙心的影响及其指纹图谱研究(1)
〔摘要〕 目的 研究附子-甘草合煎液和混合液对离体蛙心的影响及其物质基础。方法 通过离体蛙心实验观察附子-甘草合煎液和混合液对离体正常蛙心和心衰蛙心功能的影响，应用高效液相色谱法建立并测定附子-甘草煎液的HPLC指纹图谱。结果 附子-甘草合煎液与混合液的强心作用有差别;附子与甘草配伍后其指标成分的含量发生了明显变化，且合煎液与混合液的成分变化差别显著。结论 附子-甘草合煎液和混合液对离体蛙心的作用及其指纹图谱均不一致。
〔关键词〕 附子;甘草;离体蛙心;指纹图谱;合煎液;混合液
〔中图分类号〕R285.5 〔文献标志码〕A 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.02.008
附子为毛莨科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的子根的加工品，味辛甘，性大热，其功效竣猛，且有大毒[1]。有毒中药常用的解毒方法有炮制和配伍等[2]。甘草，味甘而性平，具有调和诸药之功效。附子-甘草配伍是经典药对，一般认为甘草配伍附子可起到减毒增效的作用。
研究表明，附子生物碱与甘草有效部位配伍能明显降低毒性，并协同增加附子的强心作用[3]。附子强心作用可通过离体蛙心实验加以研究，而指纹图谱是定量分析中藥的重要手段。故本实验首先在离体器官水平观察附子-甘草合煎液与单煎后混合液对离体蛙心的作用，另一方面建立附子-甘草配伍前后的HPLC指纹图谱来探讨其物质基础，以期为附子-甘草药对的药效和物质基础研究提供实验数据。
1 材料
1.1 仪器
Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);FW177型中药粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司);DK-98Ⅱ型电热恒温水浴锅(天津泰斯特仪器有限公司);RE-52AA旋转蒸发器(上海雅荣生化仪器设备有限公司);SB-5200 DTD 超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司);BL-420F 生物机能实验系统(成都泰盟软件有限公司)。
乌头碱(批号：16041801)、新乌头碱(批号：16102001)、苯甲酰新乌头原碱(批号： 16060804)、异甘草苷(批号：151120)、甘草苷(批号：160421)次乌头碱(批号：16102002)、异甘草素(批号：16061501)、甘草素(批号：151013)、甘草酸(批号：160418)，以上对照品均购自深圳菲斯生物科技有限公司。生附子产自四川江油，甘草产自甘肃，上述药材均经过湖南中医药大学中药鉴定学教研室周小江教授鉴定。乙腈、磷酸、三乙胺为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。
1.3 实验动物
蟾蜍140只，体质量110～130 g，雌雄不拘，市场购买。本实验的环境与设施条件符合中国国家标准《实验动物环境及设施》，动物实验单位的许可证编号为SYXK(湘)2013-0005。
2 方法
2.1 药液的制备
实验用药液参照文献[4-5]制备，其中，药材∶水=1∶30，附子∶甘草=1∶1，浸泡30 min后回流提取1 h，然后用纱布过滤，在70 ℃下减压浓缩，定容后制得1 mL含附子生药量0.08 g的水煎液(合煎液、混合液中的甘草生药量均为0.08 g)。实验所需药液均为新鲜制备。
2.2 离体蛙心实验
2.2.1 分组与给药 将140只蟾蜍随机分为4个药物组，即模型组、附子煎液组、附子-甘草单煎混合液组、附子-甘草合煎液组，其中每个药物组35只蟾蜍，每药物组按相邻剂量组等比设置7个浓度，每个药物浓度5只蟾蜍。然后参照文献[6-8]制备离体蛙心。 正常蛙心的给药[9]：正常离体蛙心模型制备完成后，在蛙心套管内加入1 mL的正常任氏液，先记录一段时长为2 min的离体蛙心自主曲线，然后分别加入含附子生药为0.08、0.04、0.02、0.01、0.005、0.002 5、0.001 25 g/mL的附子单煎液、附子-甘草单煎混合液、附子-甘草合煎液。加入蛙心套管内的药液体积为100 μL。加药后记录曲线2 min，完成一次给药观察后，更换离体蛙心，进行下一次给药。心衰蛙心给药[9]：离体蛙心模型制备完成后，先记录一段正常曲线，然后将蛙心套管中的液体换成1 mL的低钙任氏液，复制心衰蛙心模型，记录离体蛙心在心衰情况下的2 min自主收缩曲线，即为心衰曲线。之后操作同上。正常蛙心模型和心衰蛙心模型均按上述方法给予相同体积的提药用水。
2.2.2 指标检测与数据记录 记录蛙心心肌收缩曲线，计算蛙心的张力变化百分比，所得实验数据均使用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析。
2.3 药物HPLC指纹图谱研究
2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、异甘草苷、甘草苷、次乌头碱、异甘草素、甘草素、甘草酸对照品适量，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得浓度分别为221.2、263.6、222.0、221.2、237.6、259.6、266.8、343.2、227.2 μg/mL的对照品储备液，备用。
2.3.2 供试品溶液的制备 精密移取“2.1”下制备的药液10 mL，水浴蒸干后，加适量甲醇溶解，洗涤，转移并定容于10 mL容量瓶中，摇匀。取适量溶液置离心管中，4 000 r/min离心5 min，取上清液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。
2.3.3 色谱条件[10] 色谱柱Agilent C18 4.6 mm×150 mm，5 μm);流速1.0 mL/min;柱温30 ℃;检测波长通过全波长扫描，得出最佳波长为230 nm[11-12];运行时间70 min;进样量为20 μL。以乙腈和0.2%磷酸+0.2%三乙胺为流动相，梯度洗脱程序见表1。, 百拇医药(张序晴 彭兰 李赛 李耀伟 喻阳 曾嵘 任卫琼 邓凯文 王志琪)
〔关键词〕 附子;甘草;离体蛙心;指纹图谱;合煎液;混合液
〔中图分类号〕R285.5 〔文献标志码〕A 〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.02.008
附子为毛莨科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的子根的加工品，味辛甘，性大热，其功效竣猛，且有大毒[1]。有毒中药常用的解毒方法有炮制和配伍等[2]。甘草，味甘而性平，具有调和诸药之功效。附子-甘草配伍是经典药对，一般认为甘草配伍附子可起到减毒增效的作用。
研究表明，附子生物碱与甘草有效部位配伍能明显降低毒性，并协同增加附子的强心作用[3]。附子强心作用可通过离体蛙心实验加以研究，而指纹图谱是定量分析中藥的重要手段。故本实验首先在离体器官水平观察附子-甘草合煎液与单煎后混合液对离体蛙心的作用，另一方面建立附子-甘草配伍前后的HPLC指纹图谱来探讨其物质基础，以期为附子-甘草药对的药效和物质基础研究提供实验数据。
1 材料
1.1 仪器
Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);FW177型中药粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司);DK-98Ⅱ型电热恒温水浴锅(天津泰斯特仪器有限公司);RE-52AA旋转蒸发器(上海雅荣生化仪器设备有限公司);SB-5200 DTD 超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司);BL-420F 生物机能实验系统(成都泰盟软件有限公司)。
乌头碱(批号：16041801)、新乌头碱(批号：16102001)、苯甲酰新乌头原碱(批号： 16060804)、异甘草苷(批号：151120)、甘草苷(批号：160421)次乌头碱(批号：16102002)、异甘草素(批号：16061501)、甘草素(批号：151013)、甘草酸(批号：160418)，以上对照品均购自深圳菲斯生物科技有限公司。生附子产自四川江油，甘草产自甘肃，上述药材均经过湖南中医药大学中药鉴定学教研室周小江教授鉴定。乙腈、磷酸、三乙胺为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。
1.3 实验动物
蟾蜍140只，体质量110～130 g，雌雄不拘，市场购买。本实验的环境与设施条件符合中国国家标准《实验动物环境及设施》，动物实验单位的许可证编号为SYXK(湘)2013-0005。
2 方法
2.1 药液的制备
实验用药液参照文献[4-5]制备，其中，药材∶水=1∶30，附子∶甘草=1∶1，浸泡30 min后回流提取1 h，然后用纱布过滤，在70 ℃下减压浓缩，定容后制得1 mL含附子生药量0.08 g的水煎液(合煎液、混合液中的甘草生药量均为0.08 g)。实验所需药液均为新鲜制备。
2.2 离体蛙心实验
2.2.1 分组与给药 将140只蟾蜍随机分为4个药物组，即模型组、附子煎液组、附子-甘草单煎混合液组、附子-甘草合煎液组，其中每个药物组35只蟾蜍，每药物组按相邻剂量组等比设置7个浓度，每个药物浓度5只蟾蜍。然后参照文献[6-8]制备离体蛙心。 正常蛙心的给药[9]：正常离体蛙心模型制备完成后，在蛙心套管内加入1 mL的正常任氏液，先记录一段时长为2 min的离体蛙心自主曲线，然后分别加入含附子生药为0.08、0.04、0.02、0.01、0.005、0.002 5、0.001 25 g/mL的附子单煎液、附子-甘草单煎混合液、附子-甘草合煎液。加入蛙心套管内的药液体积为100 μL。加药后记录曲线2 min，完成一次给药观察后，更换离体蛙心，进行下一次给药。心衰蛙心给药[9]：离体蛙心模型制备完成后，先记录一段正常曲线，然后将蛙心套管中的液体换成1 mL的低钙任氏液，复制心衰蛙心模型，记录离体蛙心在心衰情况下的2 min自主收缩曲线，即为心衰曲线。之后操作同上。正常蛙心模型和心衰蛙心模型均按上述方法给予相同体积的提药用水。
2.2.2 指标检测与数据记录 记录蛙心心肌收缩曲线，计算蛙心的张力变化百分比，所得实验数据均使用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析。
2.3 药物HPLC指纹图谱研究
2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取乌头碱、新乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、异甘草苷、甘草苷、次乌头碱、异甘草素、甘草素、甘草酸对照品适量，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得浓度分别为221.2、263.6、222.0、221.2、237.6、259.6、266.8、343.2、227.2 μg/mL的对照品储备液，备用。
2.3.2 供试品溶液的制备 精密移取“2.1”下制备的药液10 mL，水浴蒸干后，加适量甲醇溶解，洗涤，转移并定容于10 mL容量瓶中，摇匀。取适量溶液置离心管中，4 000 r/min离心5 min，取上清液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。
2.3.3 色谱条件[10] 色谱柱Agilent C18 4.6 mm×150 mm，5 μm);流速1.0 mL/min;柱温30 ℃;检测波长通过全波长扫描，得出最佳波长为230 nm[11-12];运行时间70 min;进样量为20 μL。以乙腈和0.2%磷酸+0.2%三乙胺为流动相，梯度洗脱程序见表1。, 百拇医药(张序晴 彭兰 李赛 李耀伟 喻阳 曾嵘 任卫琼 邓凯文 王志琪)
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