基于信号通路p38 MAPK探讨疏风宣肺汤对大鼠慢性支气管炎模型TNF-α的影响(3)
2.3.4 Western-blot检测[9]肺组织TNF-α、p-p38MAPK蛋白的表达 将冻存管中肺组织通过破碎细胞处理裂解后放入无菌塑料离心管中，加入0.5 mL冷Lysis Buffer，手动匀浆10次，移至预冷的离心管中，4 ℃离心(10 000 r/min)5 min，取上清液至新的离心管中，分装保存于-80 ℃冰箱，用PBS稀释冻干标准品为2 000 L/mL的储存液，将25 uL的标准品和样本分别添加于微孔中，加入200 uLBCA工作液，盖上孔板盖，在37 ℃下孵育30 min后冷却至室温，测样品的吸光值OD，根据标准曲线查得相应的蛋白含量。SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，封闭结束后TBS/T(1×TBS，1%tween-20)洗3次，5 min/次。一抗1∶1 000稀释于抗体稀释液中，膜于一抗4 ℃孵育过夜，TBS/T洗3次，5 min/次;二抗1∶1 000稀释于封闭液中，膜于二抗室温孵育1 h，TBS/T洗3次，5 min/次，TMB显色5～10 min，用扫描仪扫描记录PVDF膜上的蛋白条带，红外荧光扫描系统扫描图像及相对定量，以积分吸光度(峰面积)代表蛋白条带的信号强弱 ......
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