2.2.2 免疫组化检测蛋白表达 小鼠处死后用4%多聚甲醛固定大脑，脱水后常规包埋，切片，厚度约4 μm，依次烤片、脱蜡水化，用3%过氧化氢去离子水灭活，热修复抗原，BSA封闭液封闭，加入适量一抗4 ℃冰箱过夜，PBS冲洗后二抗孵育，再次PBS冲洗滴加增敏液孵育，最后DAB显色并梯度脱水，透明，封片。每只大鼠取5张切片，使用OlympusBX71光学显微镜在200高倍镜下观察，运行Image Pro Plus 6.0图像分析软件计算阳性细胞数。另因一抗特性不同，p-S6K1、p-4E-BP1指标在DAB染色后再用苏木素复染，使用OlympusBX71光学显微镜在200倍高倍镜下观察，运行Image Pro Plus 6.0图像分析软件计算平均光密度。

    2.2.3 qRT-PCR检测mRNA表达 从引物银行下载基因序列，用Primer premier 6.0进行引物设计，并由上海生工合成。运用Trizol法提取脑组织总RNA;检测RNA浓度及质量;以Oligo(dT)18为引物采用两步法逆转录cDNA：变性RNA ......