大鼠脑缺血再灌注后层粘连蛋白表达的研究
【摘要】 目的探讨层粘连蛋白(Laminin,LN)在脑缺血再灌注损伤后的表达及其意义,为有效治疗缺血性脑病提供实验依据。方法以线栓法制作大鼠大脑中动脉阻塞的局灶性脑缺血再灌注模型,采用免疫组化、2,3,5-氯化三苯四氮唑(TTC)、H-E染色和神经行为相结合的方法,观测缺血再灌注侧大脑皮质内LN的表达、脑组织结构的变化。结果脑缺血再灌3h后,LN的表达较正常对照组明显下降,至再灌注24h降至最低点,于再灌注3d后开始回升。结论脑缺血再灌注后LN的表达先减低后回升,早期参与了血脑屏障的病理性改变,导致了继发性脑水肿损伤;稍后又参与了促使新生血管生成的过程。
【关键词】 脑缺血LN大鼠
【中图分类号】 R741【文献标识码】 A【文章编号】 1674-0742(2011)05(b)-0023-02
缺血性脑病是严重影响人类健康的疾病之一,研究脑缺血的病理机制和防治措施[1],已成为当今世界的紧迫任务。LN为细胞外基质的主要成分,与多种疾病有关,已成当今研究热点,但目前的研究主要集中于组织疾病和肿瘤等领域[2],对其在脑缺血再灌注损伤的报道甚少,为丰富实验资料,本实验对脑缺血再灌注损伤后LN的表达及其意义进行了研究,旨在为脑缺血再灌注损伤的发病机制和有效治疗提供依据。
, http://www.100md.com
1临床资料
1.1动物分组和试剂
正常成年健康雄性SD大鼠54只,购自山西医科大学实验动物中心。动物随机分为正常对照组(6只)、假手术组(6只)、脑缺血再灌注(42只)3组,其中缺血组再分为缺血2h再灌注3h(I2hR3h)、I2hR6h、I2hR12h、I2hR24h、I3hR3d、I2hR7d、I2hR14d7组,每组6只。每组中5只用于HE和免疫组化检测,1只用于TTC的染色。LN一抗和SP染色试剂盒(北京博奥森)。形态图像采集及分析系统(JD-801,江苏捷达)。
1.2建立脑缺血再灌注模型
参照Zea Longa等[3]的方法,大鼠于术前12h禁食,术前4h禁水,10%的水合氯醛0.3mL/100g体重腹腔麻醉。沿颈部正中切开皮肤,分离出颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。活结结扎CCA,夹闭ICA,结扎并烧断ECA及其分支,在ECA游离段近CCA分叉处斜剪一小口,将制备好的线栓从切口插入,线栓经CCA动脉分叉处进入ICA而入颅,栓线进入的深度以CCA分叉为准至远端约18～20mm。扎紧ECA 游离段处的备线,外留1cm线栓头。缺血2h后,抽出线栓至ECA断端处,恢复再灌注。假手术组线栓插入长度小于10mm,其余操作同缺血再灌注组。
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1.3脑缺血再灌注模型成功的判定
参照Zea Longa[3]的5分法进行评分。0分:无神经功能缺损症状,活动正常,提起鼠尾,大鼠向地面伸展两前肢;1分:轻度局灶性神经功能缺损,即提尾悬空不能伸展右侧前肢,右前肢屈曲内收,提尾悬空实验阳性;2分:中度局灶性神经功能缺损,即行走时向右侧旋转、划圈,转圈实验阳性;3分:中度局灶性神经功能缺损,即行走困难,身体向右侧倾倒;4分:不能自发行走,意识水平下降、丧失。造模成功标准为评分为1～3分者;另一种判定方法是TTC染色,如果TTC染色后左侧大脑呈白色,即代表造模成功。
1.4TTC染色
各组大鼠按规定时间点进行神经病学评分后断头处死,迅速取脑,生理盐水漂洗后置-20℃冰箱中冷冻10min,从前向后连续做2mm厚的冠状切片,置2%TTC磷酸盐缓冲液中37℃避光孵浴30min,其间每隔10min翻动1次,使脑片均匀染色。缺血侧为白色,对侧则为红色。
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1.5HE染色
二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10min→100%乙醇Ⅰ、Ⅱ各5min→95%乙醇Ⅰ、Ⅱ各5min→85%乙醇、75%乙醇各5min→蒸馏水5min→苏木素8min→自来水冲洗→1%盐酸酒精分化30s→自来水冲洗→伊红5min→自来水冲洗→75%乙醇,85%乙醇,95%乙醇Ⅰ、Ⅱ,100%乙醇Ⅰ、Ⅱ各5min→二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各10min,中性树胶封片。
1.6免疫组化检测LN的表达(SP法)
将切片常规脱蜡、复水,3%过氧化氢溶液室温孵育,抗原进行微波修复,封闭用正常兔血清工作液室温孵育。分别滴加山羊抗LN一抗(1∶100),4℃过夜;生物素标记兔抗山羊IgG二抗工作液,37℃孵育30min;辣根酶标记链酶卵白素工作液,37℃孵育30min,DAB呈色,实验中以PBS溶液代替一抗作为阴性对照。
1.7统计学处理
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实验数据采用SPSS16.0统计软件包进行统计学处理。脑缺血再灌注不同时间点的多组资料比较用单因素方差分析(one-way ANOVA),组间比较用LSD法进行,方差不齐时用Dunnett’s T3法。数据皆采用(均数±SD)表示。P<0.05为有统计学意义。
2结果
2.1病理形态学观察
TTC染色结果,白色区域代表缺血梗死部位。正常组和假手术组未见梗死苍
白区,缺血再灌注各组均有明显的梗死苍白区,并且有明显的肿胀。HE染色,假手术组与正常对照组无明显差异。脑组织形态结构均正常,神经细胞数量多而密集、饱满,排列整齐。细胞核圆形,核仁清晰可见。脑缺血再灌注组,神经元有明显的缺血性损害,细胞体变形缩小,核固缩深染。细胞数目减少,细胞间疏松。
2.2脑缺血再灌注后LN的表达变化
, 百拇医药
各时间点LN阳性的微血管计数及微血管平均光密度值(OD值)见附表。正常组和假手术组间无差异(P>0.05)。于假手术组比较,缺血组的表达规律为,LN在脑缺血再灌注后3h开始下降,至24h降至最低,于再灌注3d开始回升。LN在血管基底膜的阳性表达,为沿血管内皮细胞周围棕黄色染色。正常对照组和假手术组,微血管基底膜完整,呈连续状。缺血再灌注组,微血管基底膜出现不同程度的缺损,变薄,断裂。
附表缺血再灌注不同时间LN阳性微血管计数及OD值(均数±SD,n=5只)(表1)。R3h与R6h、R12h比较无统计学意义,R6h与R12h,R3d与R7d之间也无统计学意义,其余组间比较皆具有统计学意义(P<0.05)。
3讨论
LN是细胞外基质的主要成分,由上皮细胞和内皮细胞等合成,与Ⅳ胶原、纤维粘连蛋白等共同构成基底膜,并能与细胞表面的特异性受体连接,使基底膜和细胞机密结合。基底膜又是组成血脑屏障的成分之一,故LN的变化影响着血脑屏障的改变。有研究认为,脑缺血再灌注后可导致LN的表达减少,微血管基底膜损伤[4]。本实验结果显示,LN于再灌注3h时表达减少,24h降至最低点,此时LN标志的血管数目最少;血管基底膜中断、破碎、溶解甚至消失,血脑屏障通透性增强,导致继发性脑水肿。缺血侧脑组织苍白、饱胀、发亮;脑组织结构可观察到神经元缺血性改变,细胞体缩小,核固缩深染。细胞间疏松,呈网格状。其机理可能是:(1)脑缺血后,纤溶酶元激活物活化增强,通过一系列的酶促反应,使毛细血管基底膜的LN、Ⅳ胶原蛋白降解,导致血脑屏障受损,通透性增强,促使脑血管原性水肿[5]。(2)脑缺血后可产生大量的自由基和游离脂肪酸,活化的自由基能氧化细胞膜和基底膜上的不饱和脂肪酸,引起血管内皮细胞和基底膜损伤,导致血脑屏障通透性增强。(3)脑缺血后,内皮细胞的紧密连接遭到破坏;中性粒细胞侵润,释放各种蛋白酶、缓激肽等,促进血脑屏障的开放[6]。
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我们的究发现,LN的表达于再灌注3d时开始回升。形态学观察LN标志的阳性血管数目开始逐渐增多,并呈现出由边缘区向中心区延伸的趋势。这是由于再灌注3d时,内皮细胞开始修复,LN表达逐渐增强,促使新生血管生成。其机制为,脑缺血再灌注后,增殖的内皮细胞只有与细胞外基质黏附后才能形成管状;再者LN还能刺激细胞分泌血管内皮生长因子,促进缺血性脑损伤后血管再生和侧支循环的形成。
总之,脑缺血再灌注的早期,LN表达的减少,导致血管基底膜受损,血脑屏障通透性增强,引起血管源性脑水肿损伤;而随着在灌注时间的延长,内皮细胞开始修复,LN逐渐增多,刺激新生血管的形成。另外,LN还具有使神经元存活和增生作用,进一步促使脑损伤的修复。
参考文献
[1]颜建云,吴伟康.脑缺血损伤的分子机制研究进展[J].中国病理生理杂,2003,19(3):423～426.
, http://www.100md.com
[2]赵晓芳,孟程程,李招发.层粘连蛋白与疾病相关性的研究进展[J].生物技术通讯,2010,21(1):116～120.
[3]Zea Longa E L,Weinstein P R,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without caraniectomy in rats[J].J Stroke,1989,20(1):84～91.
[4]Hamann GF,Okada Y,Fitridge R,et al.Microvascular basal lamina a-ntigens disappear during cerebral ischemia and reperfusion[J].Stroke,1995,26:2120～2126.
[5]刘轲,李建生.脑缺血血脑屏障基底膜损伤的酶调节研究[J].中医药学刊,2004,22(3):421～426.
[6]符荣.脑缺血与血脑屏障相互关系研究进展[J].卒中与神经疾病,2003,10(6):375～377.
【收稿日期】 2011-01-03, 百拇医药(李瑞梅 杨迎春 任占川)
【关键词】 脑缺血LN大鼠
【中图分类号】 R741【文献标识码】 A【文章编号】 1674-0742(2011)05(b)-0023-02
缺血性脑病是严重影响人类健康的疾病之一,研究脑缺血的病理机制和防治措施[1],已成为当今世界的紧迫任务。LN为细胞外基质的主要成分,与多种疾病有关,已成当今研究热点,但目前的研究主要集中于组织疾病和肿瘤等领域[2],对其在脑缺血再灌注损伤的报道甚少,为丰富实验资料,本实验对脑缺血再灌注损伤后LN的表达及其意义进行了研究,旨在为脑缺血再灌注损伤的发病机制和有效治疗提供依据。
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1临床资料
1.1动物分组和试剂
正常成年健康雄性SD大鼠54只,购自山西医科大学实验动物中心。动物随机分为正常对照组(6只)、假手术组(6只)、脑缺血再灌注(42只)3组,其中缺血组再分为缺血2h再灌注3h(I2hR3h)、I2hR6h、I2hR12h、I2hR24h、I3hR3d、I2hR7d、I2hR14d7组,每组6只。每组中5只用于HE和免疫组化检测,1只用于TTC的染色。LN一抗和SP染色试剂盒(北京博奥森)。形态图像采集及分析系统(JD-801,江苏捷达)。
1.2建立脑缺血再灌注模型
参照Zea Longa等[3]的方法,大鼠于术前12h禁食,术前4h禁水,10%的水合氯醛0.3mL/100g体重腹腔麻醉。沿颈部正中切开皮肤,分离出颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。活结结扎CCA,夹闭ICA,结扎并烧断ECA及其分支,在ECA游离段近CCA分叉处斜剪一小口,将制备好的线栓从切口插入,线栓经CCA动脉分叉处进入ICA而入颅,栓线进入的深度以CCA分叉为准至远端约18～20mm。扎紧ECA 游离段处的备线,外留1cm线栓头。缺血2h后,抽出线栓至ECA断端处,恢复再灌注。假手术组线栓插入长度小于10mm,其余操作同缺血再灌注组。
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1.3脑缺血再灌注模型成功的判定
参照Zea Longa[3]的5分法进行评分。0分:无神经功能缺损症状,活动正常,提起鼠尾,大鼠向地面伸展两前肢;1分:轻度局灶性神经功能缺损,即提尾悬空不能伸展右侧前肢,右前肢屈曲内收,提尾悬空实验阳性;2分:中度局灶性神经功能缺损,即行走时向右侧旋转、划圈,转圈实验阳性;3分:中度局灶性神经功能缺损,即行走困难,身体向右侧倾倒;4分:不能自发行走,意识水平下降、丧失。造模成功标准为评分为1～3分者;另一种判定方法是TTC染色,如果TTC染色后左侧大脑呈白色,即代表造模成功。
1.4TTC染色
各组大鼠按规定时间点进行神经病学评分后断头处死,迅速取脑,生理盐水漂洗后置-20℃冰箱中冷冻10min,从前向后连续做2mm厚的冠状切片,置2%TTC磷酸盐缓冲液中37℃避光孵浴30min,其间每隔10min翻动1次,使脑片均匀染色。缺血侧为白色,对侧则为红色。
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1.5HE染色
二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10min→100%乙醇Ⅰ、Ⅱ各5min→95%乙醇Ⅰ、Ⅱ各5min→85%乙醇、75%乙醇各5min→蒸馏水5min→苏木素8min→自来水冲洗→1%盐酸酒精分化30s→自来水冲洗→伊红5min→自来水冲洗→75%乙醇,85%乙醇,95%乙醇Ⅰ、Ⅱ,100%乙醇Ⅰ、Ⅱ各5min→二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各10min,中性树胶封片。
1.6免疫组化检测LN的表达(SP法)
将切片常规脱蜡、复水,3%过氧化氢溶液室温孵育,抗原进行微波修复,封闭用正常兔血清工作液室温孵育。分别滴加山羊抗LN一抗(1∶100),4℃过夜;生物素标记兔抗山羊IgG二抗工作液,37℃孵育30min;辣根酶标记链酶卵白素工作液,37℃孵育30min,DAB呈色,实验中以PBS溶液代替一抗作为阴性对照。
1.7统计学处理
, http://www.100md.com
实验数据采用SPSS16.0统计软件包进行统计学处理。脑缺血再灌注不同时间点的多组资料比较用单因素方差分析(one-way ANOVA),组间比较用LSD法进行,方差不齐时用Dunnett’s T3法。数据皆采用(均数±SD)表示。P<0.05为有统计学意义。
2结果
2.1病理形态学观察
TTC染色结果,白色区域代表缺血梗死部位。正常组和假手术组未见梗死苍
白区,缺血再灌注各组均有明显的梗死苍白区,并且有明显的肿胀。HE染色,假手术组与正常对照组无明显差异。脑组织形态结构均正常,神经细胞数量多而密集、饱满,排列整齐。细胞核圆形,核仁清晰可见。脑缺血再灌注组,神经元有明显的缺血性损害,细胞体变形缩小,核固缩深染。细胞数目减少,细胞间疏松。
2.2脑缺血再灌注后LN的表达变化
, 百拇医药
各时间点LN阳性的微血管计数及微血管平均光密度值(OD值)见附表。正常组和假手术组间无差异(P>0.05)。于假手术组比较,缺血组的表达规律为,LN在脑缺血再灌注后3h开始下降,至24h降至最低,于再灌注3d开始回升。LN在血管基底膜的阳性表达,为沿血管内皮细胞周围棕黄色染色。正常对照组和假手术组,微血管基底膜完整,呈连续状。缺血再灌注组,微血管基底膜出现不同程度的缺损,变薄,断裂。
附表缺血再灌注不同时间LN阳性微血管计数及OD值(均数±SD,n=5只)(表1)。R3h与R6h、R12h比较无统计学意义,R6h与R12h,R3d与R7d之间也无统计学意义,其余组间比较皆具有统计学意义(P<0.05)。
3讨论
LN是细胞外基质的主要成分,由上皮细胞和内皮细胞等合成,与Ⅳ胶原、纤维粘连蛋白等共同构成基底膜,并能与细胞表面的特异性受体连接,使基底膜和细胞机密结合。基底膜又是组成血脑屏障的成分之一,故LN的变化影响着血脑屏障的改变。有研究认为,脑缺血再灌注后可导致LN的表达减少,微血管基底膜损伤[4]。本实验结果显示,LN于再灌注3h时表达减少,24h降至最低点,此时LN标志的血管数目最少;血管基底膜中断、破碎、溶解甚至消失,血脑屏障通透性增强,导致继发性脑水肿。缺血侧脑组织苍白、饱胀、发亮;脑组织结构可观察到神经元缺血性改变,细胞体缩小,核固缩深染。细胞间疏松,呈网格状。其机理可能是:(1)脑缺血后,纤溶酶元激活物活化增强,通过一系列的酶促反应,使毛细血管基底膜的LN、Ⅳ胶原蛋白降解,导致血脑屏障受损,通透性增强,促使脑血管原性水肿[5]。(2)脑缺血后可产生大量的自由基和游离脂肪酸,活化的自由基能氧化细胞膜和基底膜上的不饱和脂肪酸,引起血管内皮细胞和基底膜损伤,导致血脑屏障通透性增强。(3)脑缺血后,内皮细胞的紧密连接遭到破坏;中性粒细胞侵润,释放各种蛋白酶、缓激肽等,促进血脑屏障的开放[6]。
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我们的究发现,LN的表达于再灌注3d时开始回升。形态学观察LN标志的阳性血管数目开始逐渐增多,并呈现出由边缘区向中心区延伸的趋势。这是由于再灌注3d时,内皮细胞开始修复,LN表达逐渐增强,促使新生血管生成。其机制为,脑缺血再灌注后,增殖的内皮细胞只有与细胞外基质黏附后才能形成管状;再者LN还能刺激细胞分泌血管内皮生长因子,促进缺血性脑损伤后血管再生和侧支循环的形成。
总之,脑缺血再灌注的早期,LN表达的减少,导致血管基底膜受损,血脑屏障通透性增强,引起血管源性脑水肿损伤;而随着在灌注时间的延长,内皮细胞开始修复,LN逐渐增多,刺激新生血管的形成。另外,LN还具有使神经元存活和增生作用,进一步促使脑损伤的修复。
参考文献
[1]颜建云,吴伟康.脑缺血损伤的分子机制研究进展[J].中国病理生理杂,2003,19(3):423～426.
, http://www.100md.com
[2]赵晓芳,孟程程,李招发.层粘连蛋白与疾病相关性的研究进展[J].生物技术通讯,2010,21(1):116～120.
[3]Zea Longa E L,Weinstein P R,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without caraniectomy in rats[J].J Stroke,1989,20(1):84～91.
[4]Hamann GF,Okada Y,Fitridge R,et al.Microvascular basal lamina a-ntigens disappear during cerebral ischemia and reperfusion[J].Stroke,1995,26:2120～2126.
[5]刘轲,李建生.脑缺血血脑屏障基底膜损伤的酶调节研究[J].中医药学刊,2004,22(3):421～426.
[6]符荣.脑缺血与血脑屏障相互关系研究进展[J].卒中与神经疾病,2003,10(6):375～377.
【收稿日期】 2011-01-03, 百拇医药(李瑞梅 杨迎春 任占川)