内源性NO在人宫颈癌Hela细胞株合成对顺铂敏感性的影响(2)
1.2.5 统计方法 采用SPSS13.0统计学软件对所得的数据进行分析处理，两个独立的样本组间的均数比较用t检验，多组间的均数比较采用方差分析。
2 结果
2.1 实验组中的Hela细胞在加入IFN-γ作用4 hNO产量明显上升(97.328 μM)，IFN-γ作用8 h后NO产量达到高峰(152.335 μM)，其后随时间延长NO产量逐渐下降；而未加IFN-γ的对照组Hela细胞自始至终NO的产量无明显变化(P<0.05)。见图1。经不同浓度的IFN-γ处理Hela细胞8 h后，NO的生成量在一定范围内随IFN-γ浓度升高而上升。见图2。
2.2 以MTT法分别检测实验组与对照组Hela细胞的生存率，当DDP浓度为0.5 μM和1 μM时，实验组Hela细胞的生存率明显低于对照组(P<0.05)，但高浓度的DDP作用下，两组的Hela细胞生存率比较差异无统计学意义。见图3。
, http://www.100md.com
2.3 加入IFN-γ和NO合成促进剂L-Arg组(H组)Hela细胞经DDP作用后的生存率明显下降(P<0.05)，而加入NOS的抑制剂L-NMMA组(G组)及未加IFN-γ组(J组)Hela细胞在DDP作用后的生存率较高。
3 讨论
在NOS作用下由精氨酸脱氨基可产生NO，因其性质不稳定而较容易通过弥散出入质膜直接进入相邻的细胞，在局部发挥作用。NOS至少有3种亚型：NOSI (nNOS，神经元型)，NOSII (iNOS，炎性/免疫诱导型)，NOSIII(eNOS，内皮细胞型)，其中NOSII为诱导型(iNOS)，NOSI、NOSIII为结构型(cNOS)[4]。在某些细胞因子如γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-1(IL-1)等的诱导下，血管平滑肌细胞、巨噬细胞、心肌细胞、肝细胞或肿瘤细胞内产生iNOS[5]，而细胞内的精氨酸在iNOS的催化下通过脱氨基作用可持续产生大量的NO[6]。
, 百拇医药
研究结果表明，在加入IFN-γ的实验组中Hela细胞NO的产生量比不加IFN-γ的对照组显著增加，并且NO的生成量与IFN-γ的浓度与作用时间密切相关，由此可见在IFN-γ诱导下Hela细胞能够合成大量内源性的NO。当DDP浓度为0.5μM和1 μM时，实验组Hela细胞的生存率明显低于对照组(P<0.05)，但在高浓度DDP的作用下，两组的Hela细胞生存率差异无统计学意义(P>0.05)，说明在IFN-γ诱导下Hela细胞合成的内源性NO在一定程度上提高了细胞对DDP敏感性。通过加入iNOS抑制剂L-NMMA和NO的合成原料L-Arg来调整内源性NO的产量，得出结论：Hela细胞在DDP下的生存率在前者最高而后者降低，而导致结果不同的原因在于其生成的NO量不同，从而进一步证明了内源性NO具有调节Hela细胞对DDP敏感性的效应。
相似的研究表明 NO可增强许多化疗药物的化学敏感性。魏雪敏等[7]为了探讨NO对宫颈癌细胞增殖与凋亡的影响，选用人宫颈腺癌细胞株HeLa细胞和宫颈鳞癌细胞株Caski细胞，在培养基中加入不同浓度NO供体--硝普钠(SNP)后培养，证明了NO能抑制宫颈癌细胞的生长，促进其凋亡。在Muir等[8]的实验中，在低氧浓度下选用人乳腺癌细胞系MDA-MB-231，采用三维立体培养孵育细胞并用NO抑制剂处理细胞，然后检测抗肿瘤药物耐药性，结果显示在缺氧状态下肿瘤细胞的耐药性被NO抑制剂所加强，其机理可能为可提高肿瘤细胞化学敏感性内源性NO受到了抑制。相似的结论在Cook等人的实验中也得到体现[9]，将人乳腺癌细胞系MCF-7与可溶性NO释放药物孵育培养后加入美法仑，MCF-7细胞的生存率由未加NO释放剂时的55%降低到15%。
, http://www.100md.com
综上所述，无论是外源性还是内源性NO都已经成为了降低肿瘤细胞对化疗药物耐药性的关键因子。能够予药物促进肿瘤细胞自身合成内源性NO与给予外源性NO相比更具有可行性，因此，对其机制的进一步研究显得尤为重要，期望找到更多促使肿瘤细胞产生内源性NO的方法以达到提高肿瘤化疗敏感性的目的。
[参考文献]
[1] Conrads TP,Hood BL,Issaq HJ,et al.Proteomic patterns as a diagnostic tool for early-stage cancer:a review of it sprogress to a clinically relevant tool[J].Mol Diagn,2004,8(2): 77-85.
[2] Matthews NE, Adams MA, Maxwell LR, et al.Nitric oxide-mediated regulation of chemosensitivity in cancer cells[J].J Natl Cancer Inst,2001,93(24):1879-85.
, 百拇医药
[3] 张蓉,李斌,白萍,等.紫杉醇联合铂类在局部晚期宫颈癌新辅助化疗中的应用[J].中华肿瘤杂志,2011, 33(8):616-620.
[4] Griffith OW,Stuehr DJ. NOS:Properties and catalytic mechanism[J].Annu Rev Physiol,2005,57: 707-736.
[5] 许波,杨军,内毒素诱导巨噬细胞iNOS表达与抗肿瘤细胞毒作用的关系[J].中国癌症杂志,2003,13(2):125-127.
[6] Nossaman B,Pankey E,Kadowitz P.Stimulators and activators of soluble guanylate cyclase:review and potential therapeutic indications[J].Crit Care Res Pract,2012,29(8)：5.
, http://www.100md.com
[7] 魏雪敏,汪清,高蜀君,等.一氧化氮与HPV感染的关系及其对子宫颈癌细胞增殖与凋亡的影响[J].中华妇产科杂志,2011,46(4):260-265.
[8] Muir CP, Adams MA, Graham CH.Nitric oxide attenuates resistance to doxorubicin in three-dimensional aggregates of human breast carcinoma cells[J].Breast Cancer Res Treat,2006,96(2):169-176.
[9] Cook JA,Krishna MC,Pacelli R,et al.Nitric oxide enhancement of melphalan-induced cytotoxicity[J].Br J Cancer,1997,76(3):325-334.
(收稿日期：2012-04-20), http://www.100md.com(房姝妍等)
2 结果
2.1 实验组中的Hela细胞在加入IFN-γ作用4 hNO产量明显上升(97.328 μM)，IFN-γ作用8 h后NO产量达到高峰(152.335 μM)，其后随时间延长NO产量逐渐下降；而未加IFN-γ的对照组Hela细胞自始至终NO的产量无明显变化(P<0.05)。见图1。经不同浓度的IFN-γ处理Hela细胞8 h后，NO的生成量在一定范围内随IFN-γ浓度升高而上升。见图2。
2.2 以MTT法分别检测实验组与对照组Hela细胞的生存率，当DDP浓度为0.5 μM和1 μM时，实验组Hela细胞的生存率明显低于对照组(P<0.05)，但高浓度的DDP作用下，两组的Hela细胞生存率比较差异无统计学意义。见图3。
, http://www.100md.com
2.3 加入IFN-γ和NO合成促进剂L-Arg组(H组)Hela细胞经DDP作用后的生存率明显下降(P<0.05)，而加入NOS的抑制剂L-NMMA组(G组)及未加IFN-γ组(J组)Hela细胞在DDP作用后的生存率较高。
3 讨论
在NOS作用下由精氨酸脱氨基可产生NO，因其性质不稳定而较容易通过弥散出入质膜直接进入相邻的细胞，在局部发挥作用。NOS至少有3种亚型：NOSI (nNOS，神经元型)，NOSII (iNOS，炎性/免疫诱导型)，NOSIII(eNOS，内皮细胞型)，其中NOSII为诱导型(iNOS)，NOSI、NOSIII为结构型(cNOS)[4]。在某些细胞因子如γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-1(IL-1)等的诱导下，血管平滑肌细胞、巨噬细胞、心肌细胞、肝细胞或肿瘤细胞内产生iNOS[5]，而细胞内的精氨酸在iNOS的催化下通过脱氨基作用可持续产生大量的NO[6]。
, 百拇医药
研究结果表明，在加入IFN-γ的实验组中Hela细胞NO的产生量比不加IFN-γ的对照组显著增加，并且NO的生成量与IFN-γ的浓度与作用时间密切相关，由此可见在IFN-γ诱导下Hela细胞能够合成大量内源性的NO。当DDP浓度为0.5μM和1 μM时，实验组Hela细胞的生存率明显低于对照组(P<0.05)，但在高浓度DDP的作用下，两组的Hela细胞生存率差异无统计学意义(P>0.05)，说明在IFN-γ诱导下Hela细胞合成的内源性NO在一定程度上提高了细胞对DDP敏感性。通过加入iNOS抑制剂L-NMMA和NO的合成原料L-Arg来调整内源性NO的产量，得出结论：Hela细胞在DDP下的生存率在前者最高而后者降低，而导致结果不同的原因在于其生成的NO量不同，从而进一步证明了内源性NO具有调节Hela细胞对DDP敏感性的效应。
相似的研究表明 NO可增强许多化疗药物的化学敏感性。魏雪敏等[7]为了探讨NO对宫颈癌细胞增殖与凋亡的影响，选用人宫颈腺癌细胞株HeLa细胞和宫颈鳞癌细胞株Caski细胞，在培养基中加入不同浓度NO供体--硝普钠(SNP)后培养，证明了NO能抑制宫颈癌细胞的生长，促进其凋亡。在Muir等[8]的实验中，在低氧浓度下选用人乳腺癌细胞系MDA-MB-231，采用三维立体培养孵育细胞并用NO抑制剂处理细胞，然后检测抗肿瘤药物耐药性，结果显示在缺氧状态下肿瘤细胞的耐药性被NO抑制剂所加强，其机理可能为可提高肿瘤细胞化学敏感性内源性NO受到了抑制。相似的结论在Cook等人的实验中也得到体现[9]，将人乳腺癌细胞系MCF-7与可溶性NO释放药物孵育培养后加入美法仑，MCF-7细胞的生存率由未加NO释放剂时的55%降低到15%。
, http://www.100md.com
综上所述，无论是外源性还是内源性NO都已经成为了降低肿瘤细胞对化疗药物耐药性的关键因子。能够予药物促进肿瘤细胞自身合成内源性NO与给予外源性NO相比更具有可行性，因此，对其机制的进一步研究显得尤为重要，期望找到更多促使肿瘤细胞产生内源性NO的方法以达到提高肿瘤化疗敏感性的目的。
[参考文献]
[1] Conrads TP,Hood BL,Issaq HJ,et al.Proteomic patterns as a diagnostic tool for early-stage cancer:a review of it sprogress to a clinically relevant tool[J].Mol Diagn,2004,8(2): 77-85.
[2] Matthews NE, Adams MA, Maxwell LR, et al.Nitric oxide-mediated regulation of chemosensitivity in cancer cells[J].J Natl Cancer Inst,2001,93(24):1879-85.
, 百拇医药
[3] 张蓉,李斌,白萍,等.紫杉醇联合铂类在局部晚期宫颈癌新辅助化疗中的应用[J].中华肿瘤杂志,2011, 33(8):616-620.
[4] Griffith OW,Stuehr DJ. NOS:Properties and catalytic mechanism[J].Annu Rev Physiol,2005,57: 707-736.
[5] 许波,杨军,内毒素诱导巨噬细胞iNOS表达与抗肿瘤细胞毒作用的关系[J].中国癌症杂志,2003,13(2):125-127.
[6] Nossaman B,Pankey E,Kadowitz P.Stimulators and activators of soluble guanylate cyclase:review and potential therapeutic indications[J].Crit Care Res Pract,2012,29(8)：5.
, http://www.100md.com
[7] 魏雪敏,汪清,高蜀君,等.一氧化氮与HPV感染的关系及其对子宫颈癌细胞增殖与凋亡的影响[J].中华妇产科杂志,2011,46(4):260-265.
[8] Muir CP, Adams MA, Graham CH.Nitric oxide attenuates resistance to doxorubicin in three-dimensional aggregates of human breast carcinoma cells[J].Breast Cancer Res Treat,2006,96(2):169-176.
[9] Cook JA,Krishna MC,Pacelli R,et al.Nitric oxide enhancement of melphalan-induced cytotoxicity[J].Br J Cancer,1997,76(3):325-334.
(收稿日期：2012-04-20), http://www.100md.com(房姝妍等)