内源性NO在人宫颈癌Hela细胞株合成对顺铂敏感性的影响(1)
[摘要] 目的 通过细胞因子γ-干扰素(INF-γ)诱导内源性一氧化氮(Nitric Oxide,NO)的产生，探讨其对人宫颈癌Hela细胞株顺铂(DDP)敏感性的影响。方法 用NO测试盒检测一定浓度的INF-γ处理人宫颈癌Hela细胞在不同时间NO的产生量及一定作用时间下不同浓度的INF-γ处理Hela细胞NO的产生量；采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测经一定浓度及一定时间INF-γ处理后的人宫颈癌Hela细胞在不同浓度顺铂作用后的生存率；分别加入一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase,NOS)的抑制剂NG-甲基-L-精氨酸(L-NMMA)及NO的合成原料L-精氨酸(L-arginine,L-Arg)再次以MTT法检测Hela细胞生存率的变化。结果 体外培养的Hela细胞在经INF-γ作用后第8小时 NO生成量达高峰，随后呈下降趋势，而不加INF-γ的空白对照组，Hela细胞NO的生成量无明显变化(P<0.05)；Hela细胞NO的生成量与INF-γ的浓度之间有一定的依赖性。采取MTT法检测：经1nMINF-γ作用8 h的实验组Hela细胞与不加INF-γ的对照组相比，低浓度DDP作用时前者Hela细胞生存率显著下降(P<0.05)，但随DDP浓度升高后两组的生存率无显著差异；经1nMINF-γ处理8 h的Hela细胞加入L-NMMA组Hela细胞在DDP作用后的生存率显著提高(P<0.05)，而加入L-Arg组结果则与之相反。结论 人宫颈癌Hela细胞在一定剂量、一定时间INF-γ的作用下，能够诱导iNOS产生内源性NO，且NO产生的量与INF-γ存在时间、剂量依赖关系；经INF-γ诱导产生的内源性NO可提高人宫颈癌Hela细胞株对DDP的敏感性。
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[关键词] 宫颈癌；一氧化氮；顺铂；γ-干扰素；化学敏感性
[中图分类号] R737 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742(2012)09(c)-0020-04
宫颈癌在全球妇女恶性肿瘤中的发病率中仅次于乳腺癌，位居第2位，全球每年约有50万妇女患宫颈癌，约有20万死于该病，在发展中国家其发病率已经上升至第1位[1]。化疗是宫颈癌综合治疗的重要环节，而由于肿瘤细胞的耐药使化疗失败率上升，因此如何提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性是化疗取得成功的关键。近年来肿瘤细胞的耐药机制被人们广为研究，目前一氧化氮(Nitric Oxide,NO)对调节肿瘤细胞化疗敏感性的研究已取得一定进展 。有实验[2]表明，恶性肿瘤组织缺氧所致的NO的合成减少与肿瘤细胞耐药之间有着密切的关系，在发展迅速的肿瘤组织中给予一定量外源性促NO释放的药物后可使肿瘤细胞化疗后的生存率大为下降。顺铂(Cisplatin，DDP)是宫颈癌化疗中的经典药物，较其它化疗药物疗效显著[3]。实验通过观察人宫颈癌Hela细胞在细胞因子γ-干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)的诱导下内源性NO的产生情况，并进一步研究产生的NO是否可以提高Hela细胞对DDP敏感性以达到降低宫颈癌化疗耐药的目的。
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1 材料与方法
1.1 材料
人宫颈癌Hela细胞株，DDP，重组人干扰素-γ(Recombinant Human Interferon-γ，IFN-γ)，RPMI Medium 1640培养基，标准胎牛血清，一氧化氮测试盒(硝酸还原酶法)，MTT细胞增殖-毒性检测试剂盒，NG-甲基-L-精氨酸(L-NMMA)，L-精氨酸(L- arginine,L-Arg)。
1.2 实验方法
1.2.1 人宫颈癌Hela细胞培养。将Hela细胞置于5%的CO2培养箱中37 ℃恒温培养，培养液为PH7.2～7.4的RPMI 1640培养液，内含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL及链霉素100 U/mL。利用倒置显微镜下观察到细胞呈贴壁状态生长状态良好，用0.25%胰蛋白酶消化传代2～3次/周，当细胞呈对数生长期时用于后续的实验。
, http://www.100md.com
1.2.2 IFN-γ诱导人宫颈癌Hela细胞合成内源性NO。将Hela细胞按照1×106/mL密度接种于6孔培养板中，分别用含和不含1nM IFN-γ的培养液2 mL分别继续培养两组的Hela细胞。采用一氧化氮测试盒与紫外分光光度计在2 h、4 h、8 h、16 h、24 h后分别测定实验组与对照组培养液中NO的含量。再次将6孔培养板的Hela细胞中随机加入含不同浓度(10~13 M、10~12 M、10~11 M、10~10 M、10~9 M、10~8 M)的2 mL IFN-γ培养液，培养8 h。再次检测各孔细胞培养液中NO的含量。
1.2.3 MTT法测试经IFN-γ处理后的Hela细胞在不同浓度DDP下的生存率。将Hela细胞按照5×104/mL密度接种于96孔培养板中，100 μL/孔。随机将各孔分成实验组A(用IFN-γ处理)、实验组B(不用IFN-γ处理)、无处理因素的对照组C以及无细胞培养基的对照组D，分别向A组各小组(A组：A1、A2、A3、A4)中加入含有IFN-γ 1nM和不等浓度(0.5 μM、1 μM 、2 μM、4 μM)DDP的培养液100 μL，分别向B组各小组(B组：B1、B2、B3、B4)中加入含不等浓度(0.5 μM、1 μM 、2 μM 、4 μM)DDP的培养液100 μL。使用MTT法计算各实验组中Hela细胞的生存率。
1.2.4 经IFN-γ处理的Hela细胞加入L-Arg或L-NMMA后在DDP作用下生存率变化。按照5×104/mL的密度接种在96孔培养板中，100 μL/孔。将各孔分为实验组G、H、I、J组：G组每100 μL培养液含1nM IFN-γ、0.5 mM L-NMMA和2 μM DDP；H组每100 μL培养液含1nM IFN-γ、10 mM L-Arg 和2 μM DDP；I组每100 μL培养液含1nM IFN-γ、0.5 mM L-NMMA、10mM L-Arg和2 μM DDP；J组每100 μL培养液含0.5 mM L-NMMA、10 mM L-Arg和2 μM DDP；利用MTT法算出各实验组Hela细胞的生存率。, 百拇医药(房姝妍等)
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[关键词] 宫颈癌；一氧化氮；顺铂；γ-干扰素；化学敏感性
[中图分类号] R737 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742(2012)09(c)-0020-04
宫颈癌在全球妇女恶性肿瘤中的发病率中仅次于乳腺癌，位居第2位，全球每年约有50万妇女患宫颈癌，约有20万死于该病，在发展中国家其发病率已经上升至第1位[1]。化疗是宫颈癌综合治疗的重要环节，而由于肿瘤细胞的耐药使化疗失败率上升，因此如何提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性是化疗取得成功的关键。近年来肿瘤细胞的耐药机制被人们广为研究，目前一氧化氮(Nitric Oxide,NO)对调节肿瘤细胞化疗敏感性的研究已取得一定进展 。有实验[2]表明，恶性肿瘤组织缺氧所致的NO的合成减少与肿瘤细胞耐药之间有着密切的关系，在发展迅速的肿瘤组织中给予一定量外源性促NO释放的药物后可使肿瘤细胞化疗后的生存率大为下降。顺铂(Cisplatin，DDP)是宫颈癌化疗中的经典药物，较其它化疗药物疗效显著[3]。实验通过观察人宫颈癌Hela细胞在细胞因子γ-干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)的诱导下内源性NO的产生情况，并进一步研究产生的NO是否可以提高Hela细胞对DDP敏感性以达到降低宫颈癌化疗耐药的目的。
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1 材料与方法
1.1 材料
人宫颈癌Hela细胞株，DDP，重组人干扰素-γ(Recombinant Human Interferon-γ，IFN-γ)，RPMI Medium 1640培养基，标准胎牛血清，一氧化氮测试盒(硝酸还原酶法)，MTT细胞增殖-毒性检测试剂盒，NG-甲基-L-精氨酸(L-NMMA)，L-精氨酸(L- arginine,L-Arg)。
1.2 实验方法
1.2.1 人宫颈癌Hela细胞培养。将Hela细胞置于5%的CO2培养箱中37 ℃恒温培养，培养液为PH7.2～7.4的RPMI 1640培养液，内含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL及链霉素100 U/mL。利用倒置显微镜下观察到细胞呈贴壁状态生长状态良好，用0.25%胰蛋白酶消化传代2～3次/周，当细胞呈对数生长期时用于后续的实验。
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1.2.2 IFN-γ诱导人宫颈癌Hela细胞合成内源性NO。将Hela细胞按照1×106/mL密度接种于6孔培养板中，分别用含和不含1nM IFN-γ的培养液2 mL分别继续培养两组的Hela细胞。采用一氧化氮测试盒与紫外分光光度计在2 h、4 h、8 h、16 h、24 h后分别测定实验组与对照组培养液中NO的含量。再次将6孔培养板的Hela细胞中随机加入含不同浓度(10~13 M、10~12 M、10~11 M、10~10 M、10~9 M、10~8 M)的2 mL IFN-γ培养液，培养8 h。再次检测各孔细胞培养液中NO的含量。
1.2.3 MTT法测试经IFN-γ处理后的Hela细胞在不同浓度DDP下的生存率。将Hela细胞按照5×104/mL密度接种于96孔培养板中，100 μL/孔。随机将各孔分成实验组A(用IFN-γ处理)、实验组B(不用IFN-γ处理)、无处理因素的对照组C以及无细胞培养基的对照组D，分别向A组各小组(A组：A1、A2、A3、A4)中加入含有IFN-γ 1nM和不等浓度(0.5 μM、1 μM 、2 μM、4 μM)DDP的培养液100 μL，分别向B组各小组(B组：B1、B2、B3、B4)中加入含不等浓度(0.5 μM、1 μM 、2 μM 、4 μM)DDP的培养液100 μL。使用MTT法计算各实验组中Hela细胞的生存率。
1.2.4 经IFN-γ处理的Hela细胞加入L-Arg或L-NMMA后在DDP作用下生存率变化。按照5×104/mL的密度接种在96孔培养板中，100 μL/孔。将各孔分为实验组G、H、I、J组：G组每100 μL培养液含1nM IFN-γ、0.5 mM L-NMMA和2 μM DDP；H组每100 μL培养液含1nM IFN-γ、10 mM L-Arg 和2 μM DDP；I组每100 μL培养液含1nM IFN-γ、0.5 mM L-NMMA、10mM L-Arg和2 μM DDP；J组每100 μL培养液含0.5 mM L-NMMA、10 mM L-Arg和2 μM DDP；利用MTT法算出各实验组Hela细胞的生存率。, 百拇医药(房姝妍等)