组织蛋白质组学在动脉粥样硬化疾病中的研究进展(1)
[摘要] 动脉粥样硬化是一种高致残率和致死率的疾病之一。其分子机制的初步探明已经为疾病的预防、诊断和康复检测提供一些重要的信息，但更深层次的机制未明。该研究概述了近年来蛋白质组学技术的发展，动物模型中动脉粥样硬化组织蛋白质组学以及人类的动脉粥样硬化组织蛋白质组学的研究进展，并就动脉粥样硬化组织蛋白组学存在的问题以及发展方向作了探讨。
[关键词] 动脉粥样硬化；机制；组织；蛋白质组学
[中图分类号] R543 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742(2014)06(c)-0195-02
动脉粥样硬化是血管壁广泛病变的疾病，从血管壁的轻度增厚、血管管腔的狭窄、冠状动脉闭塞到最终的心肌梗死。在发展中以及发达国家，该疾病是一种其分子机制的初步探明已经为临床的预防、诊断和康复检测提供一些重要的信息，但更深层次的机制未明。由于蛋白质在疾病的发生发展中发挥重要作用，蛋白质组学为进一步的探讨疾病机制提供了一种较理想的方法学。当前，动脉粥样硬化的蛋白质学研究主要集中在血清生物学标记的研究，然而组织蛋白质组学却可以深层次研究细胞因子的分泌、动脉壁或细胞。该综述报道了动脉粥样硬化的组织蛋白质组学最新研究进展。
1 蛋白质组学技术的发展
目前，蛋白质组学的分析技术已经历了两代，利用2DE为第一代蛋白分离技术应用于蛋白质组学；在质谱中的ESI发展和最新进展提供了第二代蛋白质组学的方法学，该技术主要以高相液相色谱为基础，称为Shotgun蛋白质组学或MudPIT。虽然经典的蛋白质组学方法部分被Shotgun蛋白质组学取代，但粥样斑块蛋白质组学的研究原则上还是主要依靠2DE分析。另外，其他的方法还有LC-MS/MS、抗体或印迹分析以及MS成像，最近组织微阵列(TMAs)是研究血管疾病蛋白表达的强有力的工具。
2 组织蛋白质组学在动脉粥样硬化的研究
2.1 动脉粥样硬化动物模型的蛋白质组学研究
apoE缺陷小鼠是研究动脉粥样硬化病理学最理想的动物模型。最近有两项研究以apoE缺陷小鼠为模型，利用2DE分析主动脉的差异表达。第1项研究为不同主动脉损伤(轻度、中度、重度)的小鼠与野生型小鼠比较，分析蛋白差异表达。在银染胶中鉴定出79个差异表达点，这些是缺陷小鼠动脉粥样硬化早期出现的免疫活性、氧化应激和能量损伤的蛋白质。特别是，抗氧化酶蛋白1-Cys只在野生型小鼠主动脉组织中发现，而氧化形式在apoE缺陷小鼠中高表达。研究还显示，谷胱甘肽还原酶和苹果酸酶的增加与粥样斑块氧化应激和抗氧化反应一致。更为有趣的是，在apoE缺陷小鼠粥样斑块中出现免疫球蛋白的沉积[1]。第2项研究针对apoE缺陷TLR2部分缺陷或完全敲除的小鼠的主动脉进行经典的蛋白质组学研究。报道显示，TLR2+/+小鼠的斑块内单核细胞侵润、凋亡、脂质含量和前炎症因子增加，平滑肌细胞减少。进一步确认，免疫系统与引起动脉粥样硬化进展的炎症反应的联系，另外还说明了TLR2在此过程中作用。Sypro Ruby胶的差异分析，7种代表氧化应激适应性反应的蛋白(顺乌头酸酶、延胡索酸水合酶、凝溶胶蛋白、血红蛋白、肌球蛋白轻链多肽3、SOD2和Vesl-2)在TLR2+/+小鼠的斑块高表达[2]。Almofti等利用高胆固醇饮食和维生素D3注射诱导大鼠动脉粥样硬化模型，研究主动脉差异蛋白表达，通过Colloidal Coomasie 2DE胶和质谱分析，鉴定出46个蛋白。18种在疾病组织中过表达，包括一系列氧化过程中的酶如抗氧化酶2、NADH脱氢酶、Fe-S；28种下调蛋白，包括CaM-kⅢ、转移酶、果糖双磷酸醛缩酶。任何一个验证试验都认为这些蛋白参与动脉粥样硬化过程[3]。外科学方法诱导的颈动脉狭窄大鼠模型，进行转录组和蛋白质组学研究，利用2DE和银染鉴定出16个表达差异点，其中5个为2到3个蛋白的复合体。最终鉴定19种蛋白，其中8种蛋白表达水平与转录水平一致。这些研究证实，转录组学可以不必考虑翻译和翻译后蛋白水平的调控[4]。
2.2 人类动脉粥样硬化标本的研究
目前，人类粥样斑块蛋白质组学的研究比动物模型更广泛。不同的蛋白质组学技术相继被应用，从Shotgun蛋白质组学或2DE到抗体阵列和质谱成像。用于研究的斑块标本大部分来自颈动脉组织活检。
3种经典的颈动脉组织提取物的蛋白质组学从2005相继报道[5-7]。含血栓的颈动脉斑块和稳定性斑块比较，进行蛋白质组学研究，结果在含血栓的斑块中α1-抗胰蛋白酶表达上调。该结果最终通过1DE和2DE的免疫印迹验证。α1-抗胰蛋白酶在炎症条件下，由肝脏表达，能够抑制胶原蛋白酶和弹性蛋白酶活性，可能提高斑块的纤维化[5]。Part等利用2DE对颈动脉动脉粥样硬化斑块核心区和周围正常区组织进行蛋白质组学研究。21种差异蛋白被鉴定出，其中hsp27被验证并进行进一步的分析[6]。该蛋白是第一个在颈动脉斑块分泌研究中发现的具有潜在的动脉粥样硬化生物标记物[8]。Part等研究发现hsp27在斑块核心区含量周围正常区下降。其他研究结果与以前的报道相反。免疫印迹显示，正常组织hsp27表达水平较非动脉粥样硬化区，血清hsp27在患者中也增加[6]。通过其他组的后续研究hsp27水平的下降与高损伤区的面积和斑块的不稳定性有关[7，9]。最新的2DE研究包括大量的被分为含稳定性和非稳定性斑块颈动脉标本，通过MALDI-TOF质谱从胶中鉴别出大量差异点。差异表达分析结果显示，在两组中含有9种差异蛋白，包括上调蛋白：铁蛋白轻链亚基、纤维蛋白原D、SOD2；下调蛋白：膜联蛋白A1、谷胱甘肽转移酶P1-1、HSP20、HSP27、RhoGDI、SOD3。免疫印迹验证了板块中含有高水平的纤维蛋白原D，该蛋白的效应为增加血管细胞内皮通透性、分裂、前炎症刺激、化学因子的释放。Sung等建立以主动脉组织活检为基础的斑块2DE。差异分析结果显示，39差异点增加，仅有少数几个点减少。过表达的蛋白利用MALDI-TOP MS进行鉴定，其中13在动脉粥样斑块组中所有胶的1或2中高表达，而其他14个在所有胶中高表达。3个高表达蛋白进行免疫印迹确认，两个蛋白在所用胶中上调，包括膜联蛋白A5和诱捕受体；1个蛋白仅在1或2块胶中高表达，该蛋白为14-3-3γ。该研究发现的下调蛋白可以作为疾病的生物学标记物如hsp27[10]。, http://www.100md.com(张光伟 刘恩岐)
[关键词] 动脉粥样硬化；机制；组织；蛋白质组学
[中图分类号] R543 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742(2014)06(c)-0195-02
动脉粥样硬化是血管壁广泛病变的疾病，从血管壁的轻度增厚、血管管腔的狭窄、冠状动脉闭塞到最终的心肌梗死。在发展中以及发达国家，该疾病是一种其分子机制的初步探明已经为临床的预防、诊断和康复检测提供一些重要的信息，但更深层次的机制未明。由于蛋白质在疾病的发生发展中发挥重要作用，蛋白质组学为进一步的探讨疾病机制提供了一种较理想的方法学。当前，动脉粥样硬化的蛋白质学研究主要集中在血清生物学标记的研究，然而组织蛋白质组学却可以深层次研究细胞因子的分泌、动脉壁或细胞。该综述报道了动脉粥样硬化的组织蛋白质组学最新研究进展。
1 蛋白质组学技术的发展
目前，蛋白质组学的分析技术已经历了两代，利用2DE为第一代蛋白分离技术应用于蛋白质组学；在质谱中的ESI发展和最新进展提供了第二代蛋白质组学的方法学，该技术主要以高相液相色谱为基础，称为Shotgun蛋白质组学或MudPIT。虽然经典的蛋白质组学方法部分被Shotgun蛋白质组学取代，但粥样斑块蛋白质组学的研究原则上还是主要依靠2DE分析。另外，其他的方法还有LC-MS/MS、抗体或印迹分析以及MS成像，最近组织微阵列(TMAs)是研究血管疾病蛋白表达的强有力的工具。
2 组织蛋白质组学在动脉粥样硬化的研究
2.1 动脉粥样硬化动物模型的蛋白质组学研究
apoE缺陷小鼠是研究动脉粥样硬化病理学最理想的动物模型。最近有两项研究以apoE缺陷小鼠为模型，利用2DE分析主动脉的差异表达。第1项研究为不同主动脉损伤(轻度、中度、重度)的小鼠与野生型小鼠比较，分析蛋白差异表达。在银染胶中鉴定出79个差异表达点，这些是缺陷小鼠动脉粥样硬化早期出现的免疫活性、氧化应激和能量损伤的蛋白质。特别是，抗氧化酶蛋白1-Cys只在野生型小鼠主动脉组织中发现，而氧化形式在apoE缺陷小鼠中高表达。研究还显示，谷胱甘肽还原酶和苹果酸酶的增加与粥样斑块氧化应激和抗氧化反应一致。更为有趣的是，在apoE缺陷小鼠粥样斑块中出现免疫球蛋白的沉积[1]。第2项研究针对apoE缺陷TLR2部分缺陷或完全敲除的小鼠的主动脉进行经典的蛋白质组学研究。报道显示，TLR2+/+小鼠的斑块内单核细胞侵润、凋亡、脂质含量和前炎症因子增加，平滑肌细胞减少。进一步确认，免疫系统与引起动脉粥样硬化进展的炎症反应的联系，另外还说明了TLR2在此过程中作用。Sypro Ruby胶的差异分析，7种代表氧化应激适应性反应的蛋白(顺乌头酸酶、延胡索酸水合酶、凝溶胶蛋白、血红蛋白、肌球蛋白轻链多肽3、SOD2和Vesl-2)在TLR2+/+小鼠的斑块高表达[2]。Almofti等利用高胆固醇饮食和维生素D3注射诱导大鼠动脉粥样硬化模型，研究主动脉差异蛋白表达，通过Colloidal Coomasie 2DE胶和质谱分析，鉴定出46个蛋白。18种在疾病组织中过表达，包括一系列氧化过程中的酶如抗氧化酶2、NADH脱氢酶、Fe-S；28种下调蛋白，包括CaM-kⅢ、转移酶、果糖双磷酸醛缩酶。任何一个验证试验都认为这些蛋白参与动脉粥样硬化过程[3]。外科学方法诱导的颈动脉狭窄大鼠模型，进行转录组和蛋白质组学研究，利用2DE和银染鉴定出16个表达差异点，其中5个为2到3个蛋白的复合体。最终鉴定19种蛋白，其中8种蛋白表达水平与转录水平一致。这些研究证实，转录组学可以不必考虑翻译和翻译后蛋白水平的调控[4]。
2.2 人类动脉粥样硬化标本的研究
目前，人类粥样斑块蛋白质组学的研究比动物模型更广泛。不同的蛋白质组学技术相继被应用，从Shotgun蛋白质组学或2DE到抗体阵列和质谱成像。用于研究的斑块标本大部分来自颈动脉组织活检。
3种经典的颈动脉组织提取物的蛋白质组学从2005相继报道[5-7]。含血栓的颈动脉斑块和稳定性斑块比较，进行蛋白质组学研究，结果在含血栓的斑块中α1-抗胰蛋白酶表达上调。该结果最终通过1DE和2DE的免疫印迹验证。α1-抗胰蛋白酶在炎症条件下，由肝脏表达，能够抑制胶原蛋白酶和弹性蛋白酶活性，可能提高斑块的纤维化[5]。Part等利用2DE对颈动脉动脉粥样硬化斑块核心区和周围正常区组织进行蛋白质组学研究。21种差异蛋白被鉴定出，其中hsp27被验证并进行进一步的分析[6]。该蛋白是第一个在颈动脉斑块分泌研究中发现的具有潜在的动脉粥样硬化生物标记物[8]。Part等研究发现hsp27在斑块核心区含量周围正常区下降。其他研究结果与以前的报道相反。免疫印迹显示，正常组织hsp27表达水平较非动脉粥样硬化区，血清hsp27在患者中也增加[6]。通过其他组的后续研究hsp27水平的下降与高损伤区的面积和斑块的不稳定性有关[7，9]。最新的2DE研究包括大量的被分为含稳定性和非稳定性斑块颈动脉标本，通过MALDI-TOF质谱从胶中鉴别出大量差异点。差异表达分析结果显示，在两组中含有9种差异蛋白，包括上调蛋白：铁蛋白轻链亚基、纤维蛋白原D、SOD2；下调蛋白：膜联蛋白A1、谷胱甘肽转移酶P1-1、HSP20、HSP27、RhoGDI、SOD3。免疫印迹验证了板块中含有高水平的纤维蛋白原D，该蛋白的效应为增加血管细胞内皮通透性、分裂、前炎症刺激、化学因子的释放。Sung等建立以主动脉组织活检为基础的斑块2DE。差异分析结果显示，39差异点增加，仅有少数几个点减少。过表达的蛋白利用MALDI-TOP MS进行鉴定，其中13在动脉粥样斑块组中所有胶的1或2中高表达，而其他14个在所有胶中高表达。3个高表达蛋白进行免疫印迹确认，两个蛋白在所用胶中上调，包括膜联蛋白A5和诱捕受体；1个蛋白仅在1或2块胶中高表达，该蛋白为14-3-3γ。该研究发现的下调蛋白可以作为疾病的生物学标记物如hsp27[10]。, http://www.100md.com(张光伟 刘恩岐)