三氧化二砷对肠癌HCT116细胞Smads表达的影响(2)
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参见附件。
1 资料与方法
1.1 一般资料
As2O3购自哈尔滨伊达药业，人肠癌细胞HCT116由中科院上海细胞库提供，CO2培养箱购自日本SANYO公司，OLYMPUS倒置显微镜由奥地利生产，Smads抗体购于博奥森公司，其余二抗等购于武汉博士得公司。
1.2 细胞培养
复苏后的HCT116细胞接种于培养瓶中， 加入1640培养液(含热灭活胎牛血清，2 g/LNaHCO3，青霉素和链霉素各100 mg/L)中，置于恒温培养箱中培养(条件为37℃，5%CO2浓度及饱和湿度)，然后用0.15%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞用于实验。
1.3 分组及药物处理
将5×104个/mL单细胞悬液接种在96孔培养板中，其中空白对照组加10%的培养液，用于试验的低剂量组加入0.5 μmol/L浓度的As2O3，中剂量组加1.5 μmol/L As2O3，高剂量组加2.5 μmol/L的As2O3液，在培养72 h后取出细胞用于实验。
1.4 间接免疫荧光术检测Smad3、Smad7蛋白的表达
收集对数生长期的HCT-116细胞，用0.15%胰酶消化成单细胞悬液后，以1×105/mL细胞浓度接种在放有玻片的24孔培养板中，1 mL/孔，37 ℃，5%CO2孵箱中培养72 h，待细胞贴壁后，弃去上清液，换成无血清的培养液，继续培养48 h后，吸尽上清液，PBS洗5 min×3次，取出玻片，中性树胶封片(有细胞面向上)，过夜晾干，4 ℃保存备用，间接免疫荧光术检测，按试剂盒说明书进行操作(Smad蛋白抗体浓度为1∶100，荧光抗体浓度为1∶50) ......
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