真菌生物膜耐药机制与防治研究进展(1)
[摘要] 真菌已成为医院获得性感染的重要病原体，在抗真菌治疗过程中耐药性真菌的增加引起医学界广泛关注，真菌生物膜的发现和其在真菌耐药性中发挥的作用引起学者广泛的重视，真菌生物膜耐药与防治研究不断进入新领域。该文旨在阐明真菌生物膜的重要性，从生物膜的胞外机制、外排泵基因表达以及药物靶点的基因变异几个方面来阐述真菌生物膜的耐药机制，总结真菌生物膜病防治的最新研究进展。
[关键词] 真菌；生物膜；耐药机制
[中图分类号] R379 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742(2014)09(c)-0197-02
由于临床广谱抗菌药物治疗、器官移植、免疫抑制剂治疗、内置医疗器材治疗、放化疗以及艾滋病等免疫缺陷性疾病流行使得真菌感染的发病率呈上升趋势，由于效率低下的诊断方法和不恰当的初始抗真菌治疗使真菌感染死亡率高达45%[1]。真菌感染分离的真菌性病原微中白假丝酵母菌感染所占比例55%以上，甚至有报道高达66.7%[2-3]，真菌耐药性发生是临床抗真菌治疗效果不佳的重要原因，已证实病原真菌生物膜的形成是真菌产生耐药性重要因素之一[4]，临床上大约有65%的感染与微生物在组织、器官或医疗设备表面形成生物膜有关。该文从常见致病菌生物膜的形成的结构及影响因素、生物膜可能的耐药机制以及真菌生物膜病的防治方法等几个方面进行综述，阐明当前临床对真菌生物膜耐药机制与防治研究进展。
, http://www.100md.com
1 生物膜的结构及影响因素
1.1 生物膜的结构
生物膜是真菌形成菌落的生存方式，Chandra等通过激光扫描共聚焦显微镜对白色念珠菌生物膜超微结构观察发现生物膜(biofilm)是微生物群落为了自我保护而产生的一种可黏附组织表面由其自身产生的细胞外聚合物基质(ECM)包裹的三维结构菌细胞群体，对生物膜形成过程分进行详细观察后将其形成过程分为早、中、晚3 个阶段[5-6]。
1.2 生物膜形成的影响因素
生物膜的形成受包括宿主的免疫状态、营养成分、药物以及生长环境的物理、化学因素等多种因素影响。孙秋宁等研究发现血清及组织液有增加念珠菌粘附于生物材料表面的作用，能够明显增加生物膜念珠菌活性，可以促进生物膜形成[7]。
早在2002年就有研究报道白色念珠菌可以分泌一种容量感应分子法尼醇可以抑制白色念珠菌生成菌丝从而控制细胞增殖避免过量细胞造成的营养竞争， 同时促使菌体游离形成新生物膜，在生物膜形成中起重要作用[8]。
, 百拇医药
2 生物膜的耐药机制
2.1 生物膜的屏障作用
细胞外聚合物基质(ECM)是组成生物被膜结构的基质物主要由碳水化合物、蛋白质等成分组成。 碳水化合物中的主要组成部分β-1，3葡聚糖由位于细胞膜中β-1，3葡聚糖合成酶催化合成，β-1，3葡聚糖能螯合唑类抗真菌药物的被称为“药物海绵”，能够吸附大量抗真菌药物从而延迟药物渗入起到物理屏障作用，是白念珠菌生物膜耐药的重要原因[9]。
2.2 生物膜外排泵基因及相关表达
真菌基因组研究证实真菌基因组中转运蛋白编码基因所表达的蛋白产物中ATP 结合盒(ABC)转运蛋白超家族和主要易化子超家族(MFS)是真菌主要转运蛋白超家族。ABC 转运蛋白超家族是一种ATP 结合型转运蛋白包括五个蛋白家族，是主要外排蛋白，被命名为多药耐药家族(MDR)、多药耐药相关蛋白家族(MRP)和多效性耐药家族(PDRI)的3个蛋白家族与胞内毒性物质的外排密切相关[10]。MFS 转运蛋白其中两个家族，与外排毒性物质功能相关。ABC和MFS的高表达可引起多种抗真菌药特别是三唑类抗真菌药物交叉耐药[11]。Mukherjee 等通过建立基因缺失的菌株模型和检测药物外排泵的功能实验证实外排泵仅在生物膜形成早期在相关耐药性中起着重要作用[12]。
, 百拇医药
2.3 药物靶点基因变异
抗真菌药物作用机理大致可分为3种：①与真菌细胞膜成分结合破坏细胞膜完整性，如多烯类；②抑制关键酶活性，阻止细胞壁或细胞膜成分合成，如烯丙胺类、氮唑类和棘白菌素类；③干扰有丝分裂和DNA合成，如嘧啶类、抗生素类。临床常见感染性真菌对多烯类药物如两性霉素B耐药非常罕见，耐药性研究较少，学术界普遍认为真菌对多烯类药物内要可能存在3种假说[13-14]：①两性霉素B穿过真菌细胞壁通路发生改变；②细胞膜中脂类发生改变，两性霉素B与细胞膜结合机率降低了；③真菌细胞对两性霉素B药物作用敏感性降低。有文献报道通过体外诱导使ERG3基因突变使细胞膜中麦角固醇合成障碍导致两性霉素B耐药[15]。平滑假丝酵母CgERG6基因的突变促进假菌丝的生长是平滑假丝酵母耐药株对多烯类药物敏感性降低的原因。临床分离的烯丙胺类耐药菌株较少，对耐药株的角鲨烯环氧化酶编码基因(SE)进行测序分析发现1个氨基酸L393F突变，可能是其产生耐药性的原因。氮唑类抗真菌药物耐药的原因是编码其作用靶酶羊毛甾醇14α-去甲基化酶的ERG11基因变异或过度表达。棘白菌素类是由于编码β-(1，3)-D-葡聚糖合成酶的FKS1和/或FKS2基因点突变，导致真菌对脂肽类抗菌药物的敏感性明显降低。
, 百拇医药
真菌对氟胞嘧啶原发性耐药很低(<2%)，继发性耐药依赖与嘧啶药物作用不同靶酶的失活：①真菌通过编码胞嘧啶通透酶的基因fcy2点突变，影响药物的吸收降低细胞内药物积累。②编码胞嘧啶脱氨酶基因fcy1或编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因fur1的点突变也可以导致获得性氟胞嘧啶耐药。这些酶催化5-氟胞嘧啶转化为5-氟尿苷一磷酸，使药物反起作用。最常见的获得性耐药氟胞嘧啶是基于fur1基因点突变。
3 真菌生物膜病的防治
3.1 传统药物防治
采取联合使用药物的治疗策略，例如两性霉素B与氟胞嘧啶，氟胞嘧啶与氟康唑，两性霉素B与氟胞嘧啶，卡泊芬净与脂质体两性霉素B，卡泊芬净与氟康唑等的联合用药，使药物协同抗菌作用发挥疗效。, 百拇医药(郭彦伟 王凌峰 孟昭彦 焦二莉)
[关键词] 真菌；生物膜；耐药机制
[中图分类号] R379 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742(2014)09(c)-0197-02
由于临床广谱抗菌药物治疗、器官移植、免疫抑制剂治疗、内置医疗器材治疗、放化疗以及艾滋病等免疫缺陷性疾病流行使得真菌感染的发病率呈上升趋势，由于效率低下的诊断方法和不恰当的初始抗真菌治疗使真菌感染死亡率高达45%[1]。真菌感染分离的真菌性病原微中白假丝酵母菌感染所占比例55%以上，甚至有报道高达66.7%[2-3]，真菌耐药性发生是临床抗真菌治疗效果不佳的重要原因，已证实病原真菌生物膜的形成是真菌产生耐药性重要因素之一[4]，临床上大约有65%的感染与微生物在组织、器官或医疗设备表面形成生物膜有关。该文从常见致病菌生物膜的形成的结构及影响因素、生物膜可能的耐药机制以及真菌生物膜病的防治方法等几个方面进行综述，阐明当前临床对真菌生物膜耐药机制与防治研究进展。
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1 生物膜的结构及影响因素
1.1 生物膜的结构
生物膜是真菌形成菌落的生存方式，Chandra等通过激光扫描共聚焦显微镜对白色念珠菌生物膜超微结构观察发现生物膜(biofilm)是微生物群落为了自我保护而产生的一种可黏附组织表面由其自身产生的细胞外聚合物基质(ECM)包裹的三维结构菌细胞群体，对生物膜形成过程分进行详细观察后将其形成过程分为早、中、晚3 个阶段[5-6]。
1.2 生物膜形成的影响因素
生物膜的形成受包括宿主的免疫状态、营养成分、药物以及生长环境的物理、化学因素等多种因素影响。孙秋宁等研究发现血清及组织液有增加念珠菌粘附于生物材料表面的作用，能够明显增加生物膜念珠菌活性，可以促进生物膜形成[7]。
早在2002年就有研究报道白色念珠菌可以分泌一种容量感应分子法尼醇可以抑制白色念珠菌生成菌丝从而控制细胞增殖避免过量细胞造成的营养竞争， 同时促使菌体游离形成新生物膜，在生物膜形成中起重要作用[8]。
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2 生物膜的耐药机制
2.1 生物膜的屏障作用
细胞外聚合物基质(ECM)是组成生物被膜结构的基质物主要由碳水化合物、蛋白质等成分组成。 碳水化合物中的主要组成部分β-1，3葡聚糖由位于细胞膜中β-1，3葡聚糖合成酶催化合成，β-1，3葡聚糖能螯合唑类抗真菌药物的被称为“药物海绵”，能够吸附大量抗真菌药物从而延迟药物渗入起到物理屏障作用，是白念珠菌生物膜耐药的重要原因[9]。
2.2 生物膜外排泵基因及相关表达
真菌基因组研究证实真菌基因组中转运蛋白编码基因所表达的蛋白产物中ATP 结合盒(ABC)转运蛋白超家族和主要易化子超家族(MFS)是真菌主要转运蛋白超家族。ABC 转运蛋白超家族是一种ATP 结合型转运蛋白包括五个蛋白家族，是主要外排蛋白，被命名为多药耐药家族(MDR)、多药耐药相关蛋白家族(MRP)和多效性耐药家族(PDRI)的3个蛋白家族与胞内毒性物质的外排密切相关[10]。MFS 转运蛋白其中两个家族，与外排毒性物质功能相关。ABC和MFS的高表达可引起多种抗真菌药特别是三唑类抗真菌药物交叉耐药[11]。Mukherjee 等通过建立基因缺失的菌株模型和检测药物外排泵的功能实验证实外排泵仅在生物膜形成早期在相关耐药性中起着重要作用[12]。
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2.3 药物靶点基因变异
抗真菌药物作用机理大致可分为3种：①与真菌细胞膜成分结合破坏细胞膜完整性，如多烯类；②抑制关键酶活性，阻止细胞壁或细胞膜成分合成，如烯丙胺类、氮唑类和棘白菌素类；③干扰有丝分裂和DNA合成，如嘧啶类、抗生素类。临床常见感染性真菌对多烯类药物如两性霉素B耐药非常罕见，耐药性研究较少，学术界普遍认为真菌对多烯类药物内要可能存在3种假说[13-14]：①两性霉素B穿过真菌细胞壁通路发生改变；②细胞膜中脂类发生改变，两性霉素B与细胞膜结合机率降低了；③真菌细胞对两性霉素B药物作用敏感性降低。有文献报道通过体外诱导使ERG3基因突变使细胞膜中麦角固醇合成障碍导致两性霉素B耐药[15]。平滑假丝酵母CgERG6基因的突变促进假菌丝的生长是平滑假丝酵母耐药株对多烯类药物敏感性降低的原因。临床分离的烯丙胺类耐药菌株较少，对耐药株的角鲨烯环氧化酶编码基因(SE)进行测序分析发现1个氨基酸L393F突变，可能是其产生耐药性的原因。氮唑类抗真菌药物耐药的原因是编码其作用靶酶羊毛甾醇14α-去甲基化酶的ERG11基因变异或过度表达。棘白菌素类是由于编码β-(1，3)-D-葡聚糖合成酶的FKS1和/或FKS2基因点突变，导致真菌对脂肽类抗菌药物的敏感性明显降低。
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真菌对氟胞嘧啶原发性耐药很低(<2%)，继发性耐药依赖与嘧啶药物作用不同靶酶的失活：①真菌通过编码胞嘧啶通透酶的基因fcy2点突变，影响药物的吸收降低细胞内药物积累。②编码胞嘧啶脱氨酶基因fcy1或编码尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因fur1的点突变也可以导致获得性氟胞嘧啶耐药。这些酶催化5-氟胞嘧啶转化为5-氟尿苷一磷酸，使药物反起作用。最常见的获得性耐药氟胞嘧啶是基于fur1基因点突变。
3 真菌生物膜病的防治
3.1 传统药物防治
采取联合使用药物的治疗策略，例如两性霉素B与氟胞嘧啶，氟胞嘧啶与氟康唑，两性霉素B与氟胞嘧啶，卡泊芬净与脂质体两性霉素B，卡泊芬净与氟康唑等的联合用药，使药物协同抗菌作用发挥疗效。, 百拇医药(郭彦伟 王凌峰 孟昭彦 焦二莉)