TNFα通过非神经钙调蛋白途径介导皮层神经细胞损伤(2)
图1a TNFα对皮质神经元作用的量效关系。 图1b TNFα对皮质神经元作用的时效关系。
*P<0.05， **P<0.01 vs control *P<0.05 vs control
2.2 神经钙调蛋白对TNFα引起神经细胞损伤的影响
如图2a的MTT法中可以看出，TNFα与正常对照组比较，可明显引起皮层神经元的损伤(P<0.05)。而TNFα与CsA联合应用组，皮层神经元的生存力提高不明显，差异无统计学意义。在图2b的LDH释放率测定实验中可见，CsA可明显降低TNFα引起的LDH释放率的增加。TNFα和CsA联合作用组，与TNFα单独作用组一样，不能明显降低LDH的释放率(P>0.05)。
图2a MTT法观察神经钙调蛋白对TNFα引起皮质神经细胞的影响。
, http://www.100md.com
图2b LDH释放率实验观察神经钙调蛋白对TNFα引起皮质神经细胞的影响。
***P<0.001 vs control。
2.3 TNFα诱导神经细胞损伤性质及程度研究
利用PI和Annexin V 染色标记早期凋亡及坏死的细胞数目，从形态学的角度进一步证明神经钙调蛋白对细胞因子引起的损伤作用的影响。
从图3 TNFα(0.1 ng/mL)处理后， 细胞的凋亡和坏死率明显增加。CsA与TNFα联合应用组细胞，凋亡和坏死率与单纯损伤组比较无明显降低(P>0.05)
图3 TNFα诱导神经细胞损伤的免疫荧光
3 讨论
, 百拇医药
细胞因子的神经毒性和神经保护作用与促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子的平衡密切相关。在神经系统病变过程中，促炎性细胞因子变化较早，往往在神经元发生明显损伤(坏死)前即发生显著变化。在神经退行性病变过程中，脑内的促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子的产生均增加。如脑AD[1] 缺血[4]。这些炎症因子反应可能是去除致病因素的起始者和抑制神经退行性变过程。然而，一个失控的炎症反应可以促进这个过程。促炎性细胞因子如IL-1β或TNFα具有神经毒性的研究资料很多，但详细机制尚未阐明[3]。大量研究资料表明，IL-1β、TNFα对正常神经元和健康组织没有毒性作用，但在创伤，缺血，炎症性脑损伤时即使处于非常低的浓度也能加重上述损伤[5]。
CN在脑组织中的含量最为丰富，尤其是在脑皮层，海马，纹状体中[6]。CN在脑内有多种作用如淀粉β肽形成、凋亡、DARPP-32的去磷酸化、NOS的去磷酸化、基因调节、激素控制、缺血、长时程增强、记忆、突起形成、离子通道的调节等。同时也发现CN的激活对生长有负性调节作用。环孢素A(cyclosporine A，CsA)是强效的免疫抑制剂，多应用于器官移植。在淋巴细胞中CsA通过影响T细胞增殖的有关的钙依赖的信号转导而防止淋巴因子基因的激活[7]。它同时也是CN的特异性抑制剂。
, 百拇医药
该实验利用促炎性细胞因子TNFα损伤原代培养的皮质神经元，复制神经退变的细胞模型。根据TNFα的量效与时效作用曲线，在皮层神经元中分别采用 TNFα(0.1 ng/mL)的剂量损伤皮质神经元[8]。通过MTT法和LDH释放率测定实验，可以看出，大剂量的促炎性细胞因子TNFα对皮质神经元具有损伤作用，CsA可明显降低TNFα引起的LDH释放率的增加。TNFα和CsA联合作用组，与TNFα单独作用组不能可明显降低LDH的释放率(P>0.05)。此现象在免疫荧光实验结果中进一步得到证实，CsA与TNFα联合应用组细胞，凋亡和坏死率与单纯损伤组比较无明显降低(P>0.05)。因此，通过该实验，我们首次发现，神经钙调蛋白途径在TNFα引起皮质神经元损伤并不起主要作用。说明TNFα可通过非神经钙调蛋白途径引起神经元损伤。
[参考文献]
[1] Griffin WS， Stanley LC， Ling C， et al. Brain interleukin 1 and S-100 immunoreactivity are elevated in Down syndrome and Alzheimer disease[J].Proc Natl Acad Sci USA，1989，86(19)：7611-7615.
, 百拇医药
[2] 高玲，康劲松，候忠赤，等.神经钙调蛋白介导IL-1β诱导的NF-kBp65的表达及神经毒性[J].中国病理生理杂志，2005，21(4)：625-629.
[3] Wu HY， Tomizawa K， Oda Y， et al. Critical Role of calpain-mediated Cleavage of Calcineurin in Excitotoxic Neurodegeneration. J Biol Chem，2004，279(6)：4929-4940.
[4] Feuerstein GZ， Wang X， Barone， FC.The role of cytokines in the neuropathology of stroke and neurotrauma[J].Neuroimmunomodulation，1998，5(3-4)：143-159.
, 百拇医药
[5] Rothwell NJ. Sixteenth Gaddum memorial lecture December 1996. Neuroimmune interactions： the role of cytokines[J].Br J Pharmacol，1997，121(5)：841-847..
[6] Asai A， Qiu J， Narita Y， et al. High Level Calcineurin Activity Predisposes Neuronal Cells to Apoptosis[J].J Biol Chem，1999，274(11)：34450-34458.
[7] 季恩飞，刘学文.p38MAPK信号通路抑制剂对NMDA诱导的体外培养的皮层神经元损伤的保护作用及机制[J]. 山东大学学报：医学版，2013，51(11)：10-15.
[8] 高玲，贺伟，曹延平，等.神经钙调蛋白介导IL-1β引起的皮层神经元损伤 [J].中外医疗，2013，32(36)：32-33.
(收稿日期：2014-10-27), 百拇医药(高玲 郑辉)
*P<0.05， **P<0.01 vs control *P<0.05 vs control
2.2 神经钙调蛋白对TNFα引起神经细胞损伤的影响
如图2a的MTT法中可以看出，TNFα与正常对照组比较，可明显引起皮层神经元的损伤(P<0.05)。而TNFα与CsA联合应用组，皮层神经元的生存力提高不明显，差异无统计学意义。在图2b的LDH释放率测定实验中可见，CsA可明显降低TNFα引起的LDH释放率的增加。TNFα和CsA联合作用组，与TNFα单独作用组一样，不能明显降低LDH的释放率(P>0.05)。
图2a MTT法观察神经钙调蛋白对TNFα引起皮质神经细胞的影响。
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图2b LDH释放率实验观察神经钙调蛋白对TNFα引起皮质神经细胞的影响。
***P<0.001 vs control。
2.3 TNFα诱导神经细胞损伤性质及程度研究
利用PI和Annexin V 染色标记早期凋亡及坏死的细胞数目，从形态学的角度进一步证明神经钙调蛋白对细胞因子引起的损伤作用的影响。
从图3 TNFα(0.1 ng/mL)处理后， 细胞的凋亡和坏死率明显增加。CsA与TNFα联合应用组细胞，凋亡和坏死率与单纯损伤组比较无明显降低(P>0.05)
图3 TNFα诱导神经细胞损伤的免疫荧光
3 讨论
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细胞因子的神经毒性和神经保护作用与促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子的平衡密切相关。在神经系统病变过程中，促炎性细胞因子变化较早，往往在神经元发生明显损伤(坏死)前即发生显著变化。在神经退行性病变过程中，脑内的促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子的产生均增加。如脑AD[1] 缺血[4]。这些炎症因子反应可能是去除致病因素的起始者和抑制神经退行性变过程。然而，一个失控的炎症反应可以促进这个过程。促炎性细胞因子如IL-1β或TNFα具有神经毒性的研究资料很多，但详细机制尚未阐明[3]。大量研究资料表明，IL-1β、TNFα对正常神经元和健康组织没有毒性作用，但在创伤，缺血，炎症性脑损伤时即使处于非常低的浓度也能加重上述损伤[5]。
CN在脑组织中的含量最为丰富，尤其是在脑皮层，海马，纹状体中[6]。CN在脑内有多种作用如淀粉β肽形成、凋亡、DARPP-32的去磷酸化、NOS的去磷酸化、基因调节、激素控制、缺血、长时程增强、记忆、突起形成、离子通道的调节等。同时也发现CN的激活对生长有负性调节作用。环孢素A(cyclosporine A，CsA)是强效的免疫抑制剂，多应用于器官移植。在淋巴细胞中CsA通过影响T细胞增殖的有关的钙依赖的信号转导而防止淋巴因子基因的激活[7]。它同时也是CN的特异性抑制剂。
, 百拇医药
该实验利用促炎性细胞因子TNFα损伤原代培养的皮质神经元，复制神经退变的细胞模型。根据TNFα的量效与时效作用曲线，在皮层神经元中分别采用 TNFα(0.1 ng/mL)的剂量损伤皮质神经元[8]。通过MTT法和LDH释放率测定实验，可以看出，大剂量的促炎性细胞因子TNFα对皮质神经元具有损伤作用，CsA可明显降低TNFα引起的LDH释放率的增加。TNFα和CsA联合作用组，与TNFα单独作用组不能可明显降低LDH的释放率(P>0.05)。此现象在免疫荧光实验结果中进一步得到证实，CsA与TNFα联合应用组细胞，凋亡和坏死率与单纯损伤组比较无明显降低(P>0.05)。因此，通过该实验，我们首次发现，神经钙调蛋白途径在TNFα引起皮质神经元损伤并不起主要作用。说明TNFα可通过非神经钙调蛋白途径引起神经元损伤。
[参考文献]
[1] Griffin WS， Stanley LC， Ling C， et al. Brain interleukin 1 and S-100 immunoreactivity are elevated in Down syndrome and Alzheimer disease[J].Proc Natl Acad Sci USA，1989，86(19)：7611-7615.
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[2] 高玲，康劲松，候忠赤，等.神经钙调蛋白介导IL-1β诱导的NF-kBp65的表达及神经毒性[J].中国病理生理杂志，2005，21(4)：625-629.
[3] Wu HY， Tomizawa K， Oda Y， et al. Critical Role of calpain-mediated Cleavage of Calcineurin in Excitotoxic Neurodegeneration. J Biol Chem，2004，279(6)：4929-4940.
[4] Feuerstein GZ， Wang X， Barone， FC.The role of cytokines in the neuropathology of stroke and neurotrauma[J].Neuroimmunomodulation，1998，5(3-4)：143-159.
, 百拇医药
[5] Rothwell NJ. Sixteenth Gaddum memorial lecture December 1996. Neuroimmune interactions： the role of cytokines[J].Br J Pharmacol，1997，121(5)：841-847..
[6] Asai A， Qiu J， Narita Y， et al. High Level Calcineurin Activity Predisposes Neuronal Cells to Apoptosis[J].J Biol Chem，1999，274(11)：34450-34458.
[7] 季恩飞，刘学文.p38MAPK信号通路抑制剂对NMDA诱导的体外培养的皮层神经元损伤的保护作用及机制[J]. 山东大学学报：医学版，2013，51(11)：10-15.
[8] 高玲，贺伟，曹延平，等.神经钙调蛋白介导IL-1β引起的皮层神经元损伤 [J].中外医疗，2013，32(36)：32-33.
(收稿日期：2014-10-27), 百拇医药(高玲 郑辉)