1.4 引物的合成与设计

    参照NCBI数据库中Clock、PER1和β-actin的mRNA序列，使用OligoAnalyzer 3.1进行PCR引物设计，由大连宝生物公司合成引物，引物信息见表1。

    1.5 实时定量PCR反应体系

    以反转录得到的cDNA为模板，使用StepOnePlus？ Real-Time PCR System(美国Applied Biosystems Inc公司)，PCR反应体系为25 μL：cDNA 2 μL(相当于100 ng)，2× SYBR Premix Ex TaqTMⅡ×12.5 μL，10 μmol/L上游引物0.5 μL，10 μmol/L下游引物0.5 μL，双蒸水9.5 μL。反应条件：95 ℃变性5 min；扩增40个循环(95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸45 s)；72 ℃放置5 min。

    1.6 统计方法

    使用SPSS 19.0统计学软件进行数据统计，以目的基因与参比基因Ct值差值作为相对表达水平的评价指标 ......