刘晓强，吴华明，谢惠，姚熙四川省资阳市安岳县人民医院骨科，四川资阳 642350

    骨肉瘤是一种罕见的原发性骨肿瘤，在美国占不到1%[1]。然而，它是儿童和年轻人中最常见的原发性骨恶性肿瘤，约占3.4%，占所有儿童癌症和儿童骨恶性肿瘤的大部分[2]。手术切除肿瘤是治疗的基该组成部分，化疗已被证明可以改善骨肉瘤患者的生存[3]。然而，骨肉瘤患者的生存率一直保持在3年前的约60%，复发的患者中有85%发生早期肺部转移[4]。既往文献显示，骨肉瘤转移的发生与 KISS-1/G蛋白偶联受体54(GPR54)表达异常相关[5]。肿瘤转移抑制基因 KISS-1作为肿瘤抑制基因在许多肿瘤中都有被证明，如肝癌[6]、乳腺癌[7]、结肠及直肠癌[8]。在骨肉瘤体外培养细胞中，Kiss-1基因表达对细胞增殖和侵袭能力呈负相关[9]，此外，Kiss-1基因转染和过表达后，对人骨肉瘤细胞的增殖和入侵能力可能有所下降。该研究在设计时考虑到这些发现，该实验于2016年4月—2017年1月在该院细胞实验室进行，应用K7M2骨肉瘤细胞系进行研究，分别向其加入KISS1基因表达物--Kp或抗Kp蛋白，并分别与普通K7M2细胞体系进行比较，了解骨肉瘤细胞在KISS-1基因表达物的影响下的增殖、凋亡和自噬作用。

    1 材料与方法

    1.1 主要材料

    人骨肉瘤K7M2细胞，KISS1蛋白--Kp及抗Kp蛋白，流式细胞仪，cDNA合成试剂盒，RNA提取试剂盒，SYBR Premix EX Taq和定量PCR试剂盒，MTT试剂盒。

    1.2 方法

    细胞培养24、48、72 h和96 h后，用MTT染色法检查每个培养瓶细胞的增殖情况，流式细胞检测仪分析细胞凋亡情况。RT-PCR检测培养72 h后的凋亡标记物(P53、CytC)及自噬标记物(P62、Beclin1)的 mRNA表达水平。

    1.2.1 分组 对数生长期的骨肉瘤细胞K7M2在分别在加入 Kp(100 nmol/L)或者抗 Kp蛋白(100 nmol/L)的培养液中培养，并将其对应地分为Kp组及Anti-Kp组，且以普通培养的K7M2细胞形成控制对照组。

    1.2.2 细胞传代及培养 加0.25%胰蛋白酶消化后，加入含10%FBS的DMEM悬液细胞，悬液1 000 rpm×5 min离心，弃上清加入常规培养液重悬，以1×105/mL接种于新的培养瓶，将培养瓶置入37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱内培养，以后隔日换液，并适时拍照记录 ......