数字PCR检测cfDNA中KRAS突变的灵敏度研究

http://www.100md.com 2018年11月13日中外医疗 2018年第27期

微滴,泊松,突变型,1材料与方法,1标准品,2样品处理,3微滴式数字PCR方法建立,4方法学论证,2结果,1ddPCR检测线性,2健康人样本的ddPCR检测及LOD值,3讨论

     罗宇文，李瑶，景奉香

    1.复旦大学生命科学学院，上海 200438；2苏州溯源精微生物科技有限公司，江苏苏州 215300；3.中国科学院上海微系统与信息技术研究所，上海 200042

    1999年B.Vogelstein[1]在检测KRAS突变时提出了数字PCR概念。2011年数字PCR仪器问世，但是国内鲜有对数字PCR液态活检灵敏度的量化评价研究[2-4]。

    21世纪初，美国临床和实验室标准院发表了EP-17A文件—确定检测下限(Limit of Detection，LOD)与定量下限(Limit of Quantification，LOQ)的方法。同时，国际标准化组织也颁布了论述LOD的文件—ISO 11 843。但业界缺乏对于LOD重要性的认知导致的，现有的标准也忽略了现代仪器的特点而且往往只适用于正态分布[5]。该研究于2017年1月基于Bio-Rad公司的QX200微滴式数字 PCR(Droplet Digital PCR，ddPCR)系统量化评价了数字PCR对cfDNA中肠癌相关KRAS突变检测的灵敏度，并比较了计算方式间差异。为数字PCR标准化提供了方法依据，为数字PCR应用于肿瘤液态活检提供了理论依据。

    1 材料与方法

    1.1 标准品

    质粒标准品由实验室构建并克隆，选择KRAS基因12和13号外显子上7个突变型和野生型基因作为备选基因，突变型包括：G12C、G12V、G12D、G12R、G12S、G12A、G13D ......

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