Hdm2剪接体促进结直肠癌细胞增殖的分子机制(1)
[摘要] 目的 探讨Hdm2剪接体促进结直肠癌细胞增殖的分子机制。 方法 该研究内容起止时间：2015年1月—2017年12月。构建Hdm2剪接体的稳转细胞株后进行CCK-8的检测，并利用western-blot相关下游蛋白的检测。结果Hdm2剪接体与对照组相比可以促进结肠癌细胞的增殖(P<0.05)，p53和p21的表达明显下降(P<0.05)，同时上调p-p38和p38的表達(P<0.05)。 结论 Hdm2剪切体与结肠癌细胞的增殖相关，其通过下调抑癌基因p53，p21的表达，激活p-p38和p38的表达促进结直肠癌的发生和发展。
[关键词] 结直肠癌；Hdm2剪切体；mRNA；p53
[中图分类号] R735.34 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742(2018)10(c)-0001-04
[Abstract] Objective To investigate the molecular mechanism of Hdm2 splice promoting proliferation of colorectal cancer cells. Methods The start and end time of this study： from January 2015 to December 2017. The stable cell line of Hdm2 splice was constructed and tested for CCK-8， and the detection of downstream proteins related to western-blot was used. Results Hdm2 splices promoted the proliferation of colon cancer cells compared with the control group(P<0.05)， and the expression of p53 and p21 decreased significantly (P<0.05)， expression of p-p38 and p38 (P<0.05). Conclusion Hdm2 splicing is associated with the proliferation of colon cancer cells， which promotes the development and progression of colorectal cancer by down-regulating the expression of p53， p21 and activating p-p38 and p38.
[Key words] Colorectal cancer； Hdm2 splicing； mRNA； p53
结直肠癌是世界范围内高发的恶性肿瘤之一，据最新统计资料显示，全球范围内，结直肠癌的发病率和死亡率在男性患者中列第3位(10.0%)，在女性患者中列第2位(9.2%)[1]，并以每年超过100万例新增病例的速度递增，严重影响着人们的生命健康与生活质量。外界多种因素的作用导致正常上皮细胞遗传学或表观遗传学的改变，被认为是导致结直肠癌的主要原因，进一步基因突变和微环境改变加剧了结直肠癌的恶性程度。因此，深入研究结直肠癌发生发展的分子机制对明确其致病机理、早期诊断及临床治疗有重要意义。
Hdm2 是公认的致癌基因，位于人类基因染色体12q13-14，可以降解p53蛋白导致其抑癌功能失去[2-4]。早期关于Hdm2的研究发现，其mRNA具有多种剪接方式，在肿瘤的细胞系中颇为常见。异常剪接会造成基因转录的中段，其原因为成熟的mRNA中的外显子丢失，或者不可避免地将无义密码子引入而改变了读码框。其中Hdm2最常见的一种剪切形式是缺失第四，第五，第六外显子，截短的Hdm2蛋白产物仅包含p53结合域[5-7]。在细胞受到遗传毒性和致癌毒性后，Hdm2 mRNA剪切形式发生变化。然而Hdm2的选择性剪切的原因及造成的结果并不清楚。前期研究发现Hdm2的10号外显子和11号外显子在DNA损伤时会插入一段108bp序列(见图1)。插入的片段还有终止密码子，导致了11号和12号外显子的缺失。然而这两个外显子导致的结果并不是很清楚。该研究于2015年1月—2017年12月构建了Hdm2的插入108bp片段(Hdm2-S)的过表达慢病毒，研究阐明了这种选择性剪接在结直肠癌细胞中的功能及其机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验细胞 人结肠癌野生型细胞株SW1116，Caco-2，HT29，Hct116和293T购于中国科学院上海细胞所。
1.1.2 实验试剂 高糖DMEM培养基、胰蛋白酶、双抗、胎牛血清(FBS)购于美国Gibco公司；BCA蛋白定量试剂盒、PMSF、SYBR green荧光染料、Taq酶，聚丙烯酰胺预制梯度凝胶等购于Invitrogen公司；DNA 限制性内切酶，T4连接酶购自NEB公司；实验用蛋白检测抗体均购于CST公司。
1.1.3 仪器设备 分子生化实验设备：高速离心机、台式离心机、三联式水浴锅、移液枪、PCR扩增仪、电子天平、pH酸碱值测定仪、BIO-RAD电泳仪、BIO-RAD垂直电泳槽、水平电泳槽、Tanon紫外凝胶成像仪、Odyess荧光扫描仪、生物通风柜、水平摇摆仪、恒温培养箱、高压锅。
细胞培养设备：生物安全柜、电动移液器、恒温水浴锅、低温冰箱、超低温冷柜、台式低速离心机、振荡仪、Olympus倒置式荧光纤维镜、细胞培养箱。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养 将细胞株SW1116和293T分别培养于含10% FBS的DMEM培养基中，下传代至对数生长期后进行试验。SW1116细胞建立的稳转细胞株，培养条件不变。以上培养均在37℃、5% CO2的培养箱培养。, http://www.100md.com(周锋 沙德胜 刘红)
[关键词] 结直肠癌；Hdm2剪切体；mRNA；p53
[中图分类号] R735.34 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742(2018)10(c)-0001-04
[Abstract] Objective To investigate the molecular mechanism of Hdm2 splice promoting proliferation of colorectal cancer cells. Methods The start and end time of this study： from January 2015 to December 2017. The stable cell line of Hdm2 splice was constructed and tested for CCK-8， and the detection of downstream proteins related to western-blot was used. Results Hdm2 splices promoted the proliferation of colon cancer cells compared with the control group(P<0.05)， and the expression of p53 and p21 decreased significantly (P<0.05)， expression of p-p38 and p38 (P<0.05). Conclusion Hdm2 splicing is associated with the proliferation of colon cancer cells， which promotes the development and progression of colorectal cancer by down-regulating the expression of p53， p21 and activating p-p38 and p38.
[Key words] Colorectal cancer； Hdm2 splicing； mRNA； p53
结直肠癌是世界范围内高发的恶性肿瘤之一，据最新统计资料显示，全球范围内，结直肠癌的发病率和死亡率在男性患者中列第3位(10.0%)，在女性患者中列第2位(9.2%)[1]，并以每年超过100万例新增病例的速度递增，严重影响着人们的生命健康与生活质量。外界多种因素的作用导致正常上皮细胞遗传学或表观遗传学的改变，被认为是导致结直肠癌的主要原因，进一步基因突变和微环境改变加剧了结直肠癌的恶性程度。因此，深入研究结直肠癌发生发展的分子机制对明确其致病机理、早期诊断及临床治疗有重要意义。
Hdm2 是公认的致癌基因，位于人类基因染色体12q13-14，可以降解p53蛋白导致其抑癌功能失去[2-4]。早期关于Hdm2的研究发现，其mRNA具有多种剪接方式，在肿瘤的细胞系中颇为常见。异常剪接会造成基因转录的中段，其原因为成熟的mRNA中的外显子丢失，或者不可避免地将无义密码子引入而改变了读码框。其中Hdm2最常见的一种剪切形式是缺失第四，第五，第六外显子，截短的Hdm2蛋白产物仅包含p53结合域[5-7]。在细胞受到遗传毒性和致癌毒性后，Hdm2 mRNA剪切形式发生变化。然而Hdm2的选择性剪切的原因及造成的结果并不清楚。前期研究发现Hdm2的10号外显子和11号外显子在DNA损伤时会插入一段108bp序列(见图1)。插入的片段还有终止密码子，导致了11号和12号外显子的缺失。然而这两个外显子导致的结果并不是很清楚。该研究于2015年1月—2017年12月构建了Hdm2的插入108bp片段(Hdm2-S)的过表达慢病毒，研究阐明了这种选择性剪接在结直肠癌细胞中的功能及其机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验细胞 人结肠癌野生型细胞株SW1116，Caco-2，HT29，Hct116和293T购于中国科学院上海细胞所。
1.1.2 实验试剂 高糖DMEM培养基、胰蛋白酶、双抗、胎牛血清(FBS)购于美国Gibco公司；BCA蛋白定量试剂盒、PMSF、SYBR green荧光染料、Taq酶，聚丙烯酰胺预制梯度凝胶等购于Invitrogen公司；DNA 限制性内切酶，T4连接酶购自NEB公司；实验用蛋白检测抗体均购于CST公司。
1.1.3 仪器设备 分子生化实验设备：高速离心机、台式离心机、三联式水浴锅、移液枪、PCR扩增仪、电子天平、pH酸碱值测定仪、BIO-RAD电泳仪、BIO-RAD垂直电泳槽、水平电泳槽、Tanon紫外凝胶成像仪、Odyess荧光扫描仪、生物通风柜、水平摇摆仪、恒温培养箱、高压锅。
细胞培养设备：生物安全柜、电动移液器、恒温水浴锅、低温冰箱、超低温冷柜、台式低速离心机、振荡仪、Olympus倒置式荧光纤维镜、细胞培养箱。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养 将细胞株SW1116和293T分别培养于含10% FBS的DMEM培养基中，下传代至对数生长期后进行试验。SW1116细胞建立的稳转细胞株，培养条件不变。以上培养均在37℃、5% CO2的培养箱培养。, http://www.100md.com(周锋 沙德胜 刘红)