冯年花 ，谢 安 ，娄远蕾 ，阮琼芳 ，郭 菲 ，吴 珏 ，邓志锋 ，汪 泱 *

    (1、南昌大学泌尿外科研究所；2、南昌大学研究生院医学部；3、南昌大学第二附属医院神经外科，江西南昌330006)

    人诱导性多能干细胞的培养及鉴定

    冯年花1，2，谢 安1，娄远蕾1，阮琼芳1，郭 菲1，吴 珏1，2，邓志锋3，汪 泱1*

    (1、南昌大学泌尿外科研究所；2、南昌大学研究生院医学部；3、南昌大学第二附属医院神经外科，江西南昌330006)

    目的建立稳定的人诱导性多能干细胞(iPS细胞)培养体系。方法取第3～5代的小鼠胚胎成纤维细胞，丝裂霉素C处理后用作饲养层。人iPS细胞接种于饲养层上生长，胶原酶消化或机械法传代。倒置显微镜下观察iPS细胞生长状态；观察拟胚体形成能力；RT-PCR检测iPS细胞多能性基因的表达情况。结果(1)小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)为贴壁生长细胞，呈梭形或多角形。细胞增殖旺盛。(2)生长在饲养层上的人iPS细胞呈典型的克隆状生长。克隆呈圆形或椭圆形，边界清晰。克隆内细胞排列紧密，细胞体积小，核大，细胞核/质比高。RT-PCR结果显示人iPS细胞强表达多能性基因Oct4,Nanog,Sox2；去除饲养层后悬浮培养能形成拟胚体(EB)。结论本实验的培养体系适合人iPS细胞的培养，人iPS细胞能稳定增殖，保持自我更新及分化潜能。

    人诱导性多能干细胞；细胞培养；饲养层

    诱导性多能干细胞 (induced pluripotent stem cells,iPS细胞)是一种通过成体细胞重编程建立的多能干细胞，具有胚胎干细胞的特性，表达胚胎干细胞相关的多能性基因，能分化为三个胚层的细胞，移植到裸鼠体内能形成畸胎瘤[1,2]。由于可取自成体细胞，因此iPS细胞的使用可避免胚胎干细胞面临的伦理及免疫排斥问题，具有广泛的应用前景[2]。iPS细胞稳定培养体系的建立是其用于基础研究及临床疾病治疗的基础，具有重要的意义。本实验旨在建立稳定的iPS细胞培养体系，为iPS细胞的基础研究及临床应用奠定基础。

    材料与方法

    1 材料

    1.1 实验动物及细胞系来源 清洁级孕12.5天Balb/c小鼠由南昌大学医学院动科部提供；人诱导性多能干细胞系iPS-S由中科院上海生化细胞所肖磊课题组惠赠[3]。

    1.2 试剂 KnockoutTMDMEM培养基、KnockoutTM血清替代物(Serum Replacement)、高糖DMEM培养基、非必需氨基酸 (NEAA)、L-谷氨酰胺 (L-Glutamin)、-2-巯基乙醇(β-ME)、碱性成纤维生长因子(b-FGF)、Ⅳ型胶原酶 ......