黄 敏，欧东梅，徐金环，张晓梅，张义成

    (1、华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科，湖北 武汉 430030；2、广州军区武汉总医院神经内科，广东 广州；3、华中科技大学同济医学院附属同济医院血液科)

    独立生长因子Gfi1是一种锌指阻遏子，其位点是最常见的逆转录病毒插入位点之一[1]，在与Pim-1或Myc的共同作用下可显著加速T细胞淋巴瘤的发展[2]，我们采用SYBR GreenⅠ染料法通过建立实时荧光定量PCR的标准品质粒绘制标准曲线用于检测Gfi1mRNA的表达，实现样品拷贝数的准确定量。

    1 材料与方法

    1.1 实验材料 大肠杆菌E.coli DH5ɑ由本室保存；含有目的基因Gfi1cDNA的真核表达质粒plox-Gfi1由本室构建，Gfi1cDNA两端带有BamHⅠ酶切位点。

    1.2试剂 限制性内切酶BamHⅠ为大连宝生物公司；胰蛋白胨和酵母提取物为英国Oxoid公司；Taq酶为 Fermentas公司；SYBR Green I for real-time PCR液为日本TOYOBA公司；质粒小量提取纯化试剂盒为北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。

    1.3 仪器 ABI公司stepone荧光定量PCR仪；美国Biometra公司4800型PCR扩增仪；美国Beckman公司DU70型紫外分光光度仪；Alpha Innotech凝胶电泳分析系统。

    1.4 目的片断引物的设计、合成 应用软件oligo6.0，根据GenBank收录的Gfi1mRNA全序列NM005263进行设计，引物跨越内含子，避免基因组污染影响结果，目的片断Gfi1长度为176bp，引物由上海博道生物技术公司合成。引物序列：上游引物：5＇-AGACCCTTTGCCTGCGAGATGTGC-3＇，下游引物：5＇-TAGGGCCGAGTGTCTGAGTGGATA-3＇。用无菌双蒸水将引物配制成100pmol/μl的储存液-80℃冰箱保存备用。

    1.5 目的基因Gfi1cDNA质粒plox-Gfi1的鉴定 质粒plox-Gfi1经BamHⅠ酶切和PCR扩增及测序鉴定。 酶切反应体系①10×缓冲液：2μl； ②plox-Gfi1：5μl；③BamHⅠ酶：1μl；④加灭菌蒸馏水至 20μl。酶切反应条件：37℃酶切2h。PCR鉴定上下游引物分别 是 5＇-CTGGATCCCCATGCCGCGCTCATTTCTCG TCA AAAG-3＇；5＇-GCGGATCCTCATTTGAGCCCAT GC TGCGTCTCCCGGTG-3＇ ......