江梅,万腊根,简正伟,石淙,张长林

    (南昌大学第一附属医院检验科，江西 南昌330006)

    检测PML/RARα基因的双重荧光定量PCR方法的建立

    江梅,万腊根,简正伟,石淙,张长林

    (南昌大学第一附属医院检验科，江西 南昌330006)

    目的建立在一个反应体系中同时检测融合基因PML/RARα和内参基因ABL的双重荧光定量PCR方法。方法从DNA聚合酶含量、Mg2+浓度和引物浓度等方面进行优化，建立检测PML/RARα和ABL基因双重荧光定量PCR体系，从分析灵敏度，批内、批间精密度以及检测临床样本阳性率等方面对双重荧光定量PCR反应体系进行性能评价，并同时和北京思尔成公司荧光定量PCR试剂盒进行比较，分析两者的一致性。结果成功构建双重荧光定量PCR反应体系，检测质粒灵敏度为103copies/ml，检测NB4细胞的灵敏度为10-3，反应体系批内、批间精密度Ct值的变异系数CV都小于5%，检测20例确诊为APL病人，其检测阳性率，和北京思尔成公司的PCR反应试剂一致。结论成功开发出稳定的双重荧光定量PCR试剂盒，其操作简单，成本低，误差小，能够有效地用于APL分子生物学分型诊断、用药指导、预后观察及MRD监测。

    荧光定量PCR；PML/RARα；ABL；急性早幼粒细胞白血病

    急性早幼粒细胞白血病 (acute promyelocytic leukemia，APL)是较为常见的急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML) 的一种特殊类型[1]。研究表明，98%以上的APL病人出现非随机的染色体易位 t(15；17)(q22；q21)，造成 PML、RARa 基因重排而形成PML/RARα融合基因[2]，该融合基因在APL白血病的发生中起关键作用，同时也成为APL特异性的分子标志。因此对APL病人PML/RARα融合基因的检测成为APL分子生物学分型诊断、用药指导、预后观察及微小残留病 (minimal residual disease，MRD)诊断的重要技术手段[3]。 临床上检测PML/RARα融合基因的方法很多，最常用的是荧光定量RT-PCR，为了实现操作简单，成本低，误差小，本研究拟在已有的工作基础上，建立在一个反应体系中同时检测PML/RARα和ABL的双重荧光定量PCR方法，该方法在一个反应体系中检测两个基因，这样可以减少试剂用量，同时减少操作步骤，大大减少实验成本和实验时间。

    1 材料与方法

    1.1 实验材料

    1.1.1 材料 RPMI-1640培养基、D-Hanks、FBS购于 Hyclone公司、Trizol、DNA Marker为天根公司产品、RT试剂盒、RNA酶抑制剂为TaKaRa公司产品、实时荧光定量PCR试剂盒购于北京思尔成生物技术有限公司、Tap DNA Polymerase购自Fermentas公司、dNTP和人淋巴细胞分离液购自Solarbio公司、E.coli DH5α 和质粒 PCMV4-PML/RARα-ABL为本室自藏 ......