张才成，陈 静，陈唐勇，章登珊，郑晓丰，李俊明

    (1、南昌大学第一附属医院检验科，江西南昌330006；2、江西护理职业技术学院，江西南昌330006)

    mTOR特异性siRNA重组表达载体的构建及鉴定

    张才成1，陈 静2，陈唐勇1，章登珊1，郑晓丰1，李俊明1

    (1、南昌大学第一附属医院检验科，江西南昌330006；2、江西护理职业技术学院，江西南昌330006)

    目的构建mTOR siRNA重组表达载体，为探讨RNA干扰技术抑制巨噬细胞mTOR基因的相关研究奠定基础。方法设计具有短发夹结构的DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pGPU6/GFP/Neo中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定。再转染入巨噬细胞RAW264.7,进行荧光摄像和阳性克隆筛选。Western blot方法检测巨噬细胞mTOR蛋白表达。结果DNA测序结果及PCR鉴定证实成功构建小鼠mTOR siRNA重组表达载体。Western blot结果显示转染该重组载体的巨噬细胞mTOR蛋白表达下降约41%。结论mTOR靶向RNA干扰重组表达载体构建成功,可以进行稳定筛选，该载体对巨噬细胞mTOR蛋白表达有抑制作用。

    mTOR;RNA干扰;重组表达载体

    哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)作为一种重要的信号传导分子,参与细胞多种生理和病理过程,调节多种生物化学过程,对基因的转录调控发挥重要作用[1]。RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术已经成为基因功能研究中非常重要的工具，为研究某些基因功能提供了重要的手段。为此,我们设计构建并筛选了针对mTOR的siRNA重组表达载体，为进一步研究mTOR调控内源性巨噬细胞，促进巨噬细胞杀灭胞内病原体奠定实验基础。

    1 材料与方法

    1.1 材料限制性内切酶、连接酶、质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒等主要试剂为Promega公司和宝生物公司产品；转染试剂盒购自Invitrogen公司；Western Blot试剂为Santa Cruz公司产品(包括兔抗鼠单克隆一抗和HRP结合的山羊抗兔二抗等)；siRNA寡核苷酸序列和PCR引物合成及测序由上海生工公司完成；小鼠巨噬细胞RAW264.7和质粒pGPU6/GFP/Neo本实验室保存。

    1.2 方法

    1.2.1 siRNA序列设计与合成在GenBank中查到小鼠mTOR基因的mRNA序列,通过Invitrogen公司在线软件设计siRNA寡核苷酸序列及其互补的反义链 ......