杨洁，贺松

    (成都大学附属医院,四川成都610081)

    乳酸乳球菌Nisin抗性基因的异源性表达和活性研究

    杨洁，贺松

    (成都大学附属医院,四川成都610081)

    目的评估乳酸乳球菌Nisin抗性基因在德氏乳杆菌保加利亚亚种的表达活性，为建立食品级筛选标记做准备。方法将新鲜牛奶接种于含有400μg/ml乳酸链球菌素的M17平板上，在分离的菌株中筛选乳酸乳球菌，同时提取其基因组DNA和质粒DNA，根据已公布的Nisin抗性基因序列设计一对引物，以提取的基因组DNA和质粒DNA为模板进行PCR扩增，产物进行电泳分析。将目的基因插入到大肠杆菌乳杆菌穿梭质粒—pMG36e中，并在德式乳杆菌保加利亚亚种中观察目的基因的表达活性及其作为筛选标记的活性。结果成功筛选出对Nisin具有抗性的乳酸乳球菌，进行目的基因扩增后成功将目的基因转化到L6032中，并表达出Nisin抗性。结论在德式乳杆菌保加利亚亚种中成功克隆及表达出Nisin抗性基因。

    乳酸乳球菌；德式乳杆菌保加利亚亚种；Nisin抗性基因；食品级筛选标记

    乳酸链球菌素(Nisin)是乳酸链球菌产生的一种多肽物质，由34个氨基酸残基组成[1]。食用后在人体的生理PH条件和α-胰凝乳蛋白酶作用下很快水解成氨基酸，不会改变人体肠道内正常菌群以及产生如其它抗菌素所出现的抗性问题，更不会与其它抗菌素出现交叉抗性，是一种高效、无毒、安全、无副作用的天然食品防腐剂[2,3]，在全球48个国家合法使用[4]。乳酸链球菌素(Nisin)能有效抑制引起食品腐败的许多革兰氏阳性细菌[5,6]，如乳杆菌、明串珠菌、小球菌、葡萄球菌、李斯特菌[7,8]等，特别是对产芽孢的细菌如芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌有很强的抑制作用[4]。通常，产芽孢的细菌耐热性很强，如鲜乳采用135℃、2s超高温瞬时灭菌，非芽孢细菌的死亡率为100%，芽孢细菌的死亡率90%，还有10%的芽孢细菌不能杀灭。若鲜乳中添加0.03～0.05g/kg Nisin就可抑制芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌孢子的发芽和繁殖。Nisin的抑菌机制为：吸附于敏感菌的细胞膜上，其C末端侵入膜内形成通透孔道，允许分子量小于0.5kDa的亲水分子流入，而导致细胞膜去极化及ATP的泄漏，细胞自溶而死亡[9,10]。乳酸乳球菌的Nisin抗性基因通常来源于两个因素：对于能产Nisin抗性基因的乳酸乳球菌菌株，NisI基因在Nisin免疫中有重要的作用[11,12]；对于非产Nisin抗性基因的乳酸乳球菌，能编码Nisin抗性序列[13] ......