聂志文，梁振山，曾令兵

    (1、上海市第一人民医院宝山分院检验科，上海200940；2、江西省儿童医院检验科，江西 南昌330006；3、南昌大学第一附属医院，江西 南昌330006)

    钩端螺旋体病(简称“钩体病”)是世界范围内流行的人兽共患病[1-3]。钩体病的临床症状轻重、缓急不一，轻症患者可只表现为感冒样症状；而重症患者则可出现肝、肾、肺等多脏器的出血性病变，甚至死亡[4]。目前，钩体病的关键致病因子还未完全阐明[5]。本研究在前期分泌蛋白质组的基础上，对其中筛选得到的问号钩体外分泌蛋白的致病功能进行研究，为进一步阐明问号钩体的致病因子及致病机制提供必要的依据[6]。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 基因组 由上海交通大学病原生物学教研室提供问号钩体56601株的基因组。

    1.1.2 菌株和质粒 克隆菌株为E.coli DH5α，表达宿主为E.coli Bl21(DE3)，均购于天根生物有限公司。表达载体为pET28a(+)由上海交通大学病原生物学教研室馈赠。

    1.1.3 试剂 KOD-plus购于TOYOBO公司。限制性内切酶及连接酶Solution I，购于TAKARA公司。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)购于Promega公司。蛋白至分子量标准购自Fermentas公司。其他试剂均为进口分装。

    1.1.4 问号钩体感染兔血清 该血清由上海交通大学病原生物学教研室馈赠。由问号钩体强毒株56601株，经耳缘静脉注射感染新西兰兔制备获得。

    1.1.5 培养基 配制LB培养基：1%NaCl，1%胰蛋白胨以及0.5%酵母浸出液，百分比为质量体积比。1.1.6引物 由上海Invitrogen公司合成。

    1.2 方法

    1.2.1 四个钩体外分泌蛋白表达载体的构建 PCR反应条件如下，预变性：95℃ 2min；扩增步骤：95℃变性 1min；55℃退火 30s；68℃延伸 1~2min(延伸时间由产物大小决定)；进行35个循环；72℃延伸10min。PCR引物见表1。

    表1 钩体外分泌蛋白重组克隆引物

    1.2.2 获得的PCR产物在相应的限制性内切酶作用后，在连接酶Solution I的作用下，与pET28a(+)连接 ......