朱义保，谢彤，杨亮亮，万磊

    (江西省妇幼保健院，江西 南昌 330006)

    大量的流行病学和分子生物学研究资料表明，人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染与宫颈癌及癌前病变关系密切，是宫颈癌的主要危险因素。研究发现在HPV致癌过程中，常发生HPV E2基因的缺陷，E2完整性遭到破坏，引起致癌性基因E6、E7过量表达，高表达的E6和E7通过与细胞抑癌基因P53和Rb蛋白产物作用并使之失活，导致细胞无限制生长进而引起癌变[1]。因此在本课题中，我们以感染HPFV16的不同宫颈病变为标本，提取DNA，用定量PCR的方法分析HPV16 E2/E7的比值，描述病毒的存在状态，探讨病毒整合与宫颈病变程度的关系。

    1 资料与方法

    1.1 研究对象 选择来我院诊治的住院患者，用塑料毛刷取样器采集宫颈脱落细胞，根据患者的病理结果和HPV16感染情况，选取慢性宫颈炎21例，CINⅠ4例，CINⅡ22例，CINⅢ 23例，宫颈癌28例。这些患者无子宫切除术史、无急性生殖道炎症、无盆腔放射治疗史、无细胞学检查异常或宫颈上皮内瘤变史、非月经期、非孕期、患者检查前24h未进行性生活、药水冲洗及阴道用药等。

    1.2 主要试剂及仪器 HPV16质粒(P1203)由美国Addgene公司惠赠。DNA提起试剂盒、质粒提取试剂 盒 、PCR 试 剂 、SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)试剂等购自为北京天为时代公司，ABI 7300实时荧光定量基因扩增仪为美国Applied Biosystems产品。

    1.3 DNA提取 从宫颈管采样，样品分2份，一份做人乳头瘤病毒分型检测，另一份备用，对于人乳头瘤病毒分型检测HPV16阳性的标本，取相应的备用样品提取DNA，相关步骤参见北京天为DNA提取试剂盒。为确认样品HPV16的感染，对提取后的DNA进行HPV16 E7基因扩增，通过凝胶电泳确认样品存在HPV16感染。

    1.4 E2和E7基因定量PCR扩增条件 引物由华大基因公司合成，HPV16 E2上游引物 5’-TGCGCCTAGAATGTGCTATTTA-3’，下游引物 5’-TCTTTGATACAGCCAGTGTTGG-3’ ......