刘志强，柯江维，乐萍，段荣

    (江西省儿童医院检验科，江西 南昌330006)

    近几年,随着多药联合强化治疗的实施，儿童急性淋巴细胞白血病 (acute lymphoblastic leukaemia,ALL)的长期无病存活率明显提高,部分发达国家已达90%[1],但仍有患儿复发死亡。如何防止复发、避免不必要的过度化疗一直是儿科血液肿瘤研究者期待解决的问题。近年来大量相关研究提出,ALL复发的主要原因之一是白血病诱导化疗完全缓解后,在体内残留微量白血病细胞,即微小残留病变(minimal residual disease，MRD)[2]。 目前适合MRD检测的方法只有聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)和流式细胞术(flow cytometry，FCM)[3]。本研究应用实时定量PCR(realtime quantitative PCR，RQ-PCR),对 153例 ALL患儿化疗前、诱导化疗结束及强化治疗末期骨髓样本的MRD进行监测,以评估其在预测复发、指导个体化治疗方面的应用价值。

    1 资料与方法

    1.1 研究对象 收集2010年3月-2014年6月期间江西省儿童医院血液科病房收治的376例急性淋巴细胞白血病患儿资料，其中男151例，女225例，中位年龄5.4岁(1.6月～14岁)。所有患儿均经细胞形态学-免疫学-细胞遗传学-分子遗传学(MICM)进行诊断及分型。从诱导化疗结束为完全缓解后开始列入随访，平均随访时间28月(10～41月)。

    1.2 治疗方案 按2006年中华医学会儿科学分会血液学组儿童ALL诊疗建议(第三次修订草案)[4]及2010年全国儿童ALL临床路径方案进行治疗。以诱导化疗结束骨髓涂片检查时原幼淋巴细胞<5%为骨髓完全缓解。化疗前均已征得患儿家属的知情同意。

    1.3 标本采集 分别于治疗前、诱导化疗结束后、强化治疗后抽取骨髓肝素抗凝标本2ml。

    1.4 融合基因检测

    1.4.1 总RNA提取 将抽取的骨髓标本经Ficoll Hypaque淋巴细胞分离液密度梯度离心分离单个核细胞。用RNA Isolation Kit(Promega SV Total RNA Isolation System购自美国Promega公司)提取总RNA。

    1.4.2 cDNA合成 反转录的反应体系(试剂购自大连宝生物有限责任公司):(1)5×Prime ScriptTMBuffer(for Real Time)2μl;(2)Prime ScriptTMRT Enzyme MixⅠ0.5μl;(3)Oligo(dT)Primer(50μmol·L-1)0.5μl;(4)Random 6 mers(100μmol·L-1)2μl;(5)Total RNA 1μg;(6)RNase Free双蒸水 (dH2O)补充至反应体系10μl ......