胡音音，杜伟鹏，张亚东，卢庆文，李向阳

    (1.南阳市中心医院检验科，河南 南阳473009；2.南阳市中心医院肝脏外科，河南 南阳473009；3.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院，浙江 温州325027)

    随着鲍曼不动杆菌临床分离率的不断攀升及多重耐药和泛耐药菌株的不断涌现， 该菌的感染已成为国内乃至世界面临的一大公共卫生问题。Ⅵ型分泌系统(Type ⅥSecretion System, T6SS)是存在于大多数革兰阴性杆菌中的一种新型分泌系统， 对其功能研究发现该系统不仅参与细菌间的种群竞争作用，具有杀伤异种菌功能，还与细菌毒力相关[1-2]。 作为T6SS 的核心组分，溶血素共调节蛋白(Hemolysin-coregulated protein，Hcp)的 检 测是验证T6SS 活性最重要的方法，因此其单克隆抗体的制备显的尤为重要。 另外，Hcp 蛋白家族本身又是一种效应因子，参与细菌的致病过程[3]，但其在鲍曼不动杆菌致病性中的研究甚少。 本研究拟构建鲍曼不动杆菌Hcp 原核表达载体， 探索蛋白表达情况并纯化Hcp 蛋白，为后续研究奠定基础。

    1 材料与方法

    1.1 材料 pET-28a(+)质粒、ATCC17978 标准菌株和E.coli BL21(DE3)菌株为本实验室自存。pJET1.2克隆载体和CloneJET PCR Cloning 试剂盒购于美国Thermo 公司，IPTG、卡那霉素及质粒提取、DNA回收、PCR 产物纯化的试剂盒均购于上海捷瑞生物有限公司，T4 DNA Ligase、Xho Ⅰ和Nco Ⅰ内切酶购于大连宝生生物有限公司，细菌DNA 提取试剂盒、His 蛋白纯化试剂盒、鼠抗-His 多克隆抗体、羊抗鼠IgG(HRP 标记)、蛋白酶抑制剂(PMSF)均购于碧云天上海生物有限公司， PVDF 膜、蛋白超滤管等购于美国Millipore 公司。

    1.2 方法

    1.2.1 Hcp 基因扩增及产物纯化 采用DNA 提取试剂盒提取ATCC17978 菌株全基因组DNA，根据Hcp 基因序列，参照pET-28a (+)质粒的限制性酶切位点设计合成一对带有Xho Ⅰ和Nco Ⅰ位点的特 异性引物 ......