李钻芳 陈文列 陈荣

    激光扫描共聚焦显微术(laser scanning confocal microscopy，LSCM)是先进的细胞和分子生物研究技术，是在荧光显微镜的基础上配置激光光源，扫描装置，共聚焦装置和检测系统加以数据化的图像处理技术而形成的新型显微镜技术，因其独特的激光扫描装置，具有不损伤细胞、共焦成像分辨率高、能层析扫描、实现多重荧光共定位以及能观察样品的三维图像等优点，已被广泛应用于形态学、细胞生物学、分子生物学、发育生物学、神经科学、药理学、遗传学和环境科学以及抗肿瘤药物研究等领域。

    1 LSCM在肿瘤细胞凋亡检测中的优势

    促进肿瘤细胞凋亡是许多中药杀伤肿瘤细胞的重要途径，中药诱导细胞凋亡成为中医药抗肿瘤机制的研究热点之一。细胞凋亡时伴随染色质的降解及凋亡相关信号的传递，中药可对细胞凋亡过程的不同环节进行调节，进而促进细胞凋亡，维持机体内平衡，延缓或阻止组织病理过程的恶化。

    细胞凋亡的常用检测有形态学的光学显微镜、电子显微镜观察，生物化学的DNA凝胶电泳法，流式细胞术等方法，但各自都有一定的局限性，如电镜观察制样程序费时、不易定量，流式细胞术检测的是群体细胞或某一类细胞的各凋亡指标，无法对单个细胞进行定位分析，无法确定凋亡位点。而激光扫描共聚焦显微术，通过结合各种特异性荧光探针，不仅能实现核酸、蛋白质、抗体、受体等大分子的定位、定性、定时及定量检测，还能从分子水平检测到单细胞在活性状态下的各指标信号，在观察细胞形态、检测凋亡进程及测定活细胞凋亡过程中钙离子、线粒体膜电位、活性氧自由基变化等方面得到广泛应用。

    2 LSCM在中药与天然药诱导肿瘤细胞凋亡研究中的应用

    2.1 观察细胞核变化与凋亡小体

    经特异性的DNA、RNA荧光探针(如吖啶橙AO、碘化丙啶PI)或DNA荧光探针(如Hoechst33258、Hoechst33342、DAPI)等标记后的细胞，用LSCM能获得其细胞核清晰的图像，能直观地显示细胞受损后DNA和RNA的变化，在凋亡细胞的LSCM图像上可见细胞核染色质浓缩、DNA凝结而成的凋亡小体等；而AO或PI还可显出细胞轮廓、凋亡细胞出芽等。不同于电镜下观察，LSCM能够在保持细胞活性及完整性的前提下，对细胞进行观察和测量，其图像质量好、分辨率高，可以实现多重荧光信号共同观察，甚至可以获得细胞三维重建图像。此外，通过结合显示凋亡早期细胞膜变化的灵敏指标Annexin V，可准确定位与定量观察细胞膜与细胞核的凋亡位点 ......