谭琳蓥 赵天平 国兰琴 赵琛 刘慧荣 朱慧华 崔云华

    衰老是生物体各种功能普遍衰弱，以及抵抗环境伤害和恢复体内平衡能力降低的过程[1]。近年来，全球老年人口比重迅速上升[2]，探索衰老机理，延缓衰老、防治与衰老相关的疾病、提高老年人的生活质量，对全球的经济发展和卫生事业将带来重大的影响。本研究采用自然衰老大鼠模型，观察温和灸“肾俞”穴对自然衰老大鼠肝组织原癌基因Rb(Rb)、原癌基因P53(P53)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、蛋白激酶C(PKC)表达的影响，以期进一步探讨艾灸延缓衰老的机制。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物

    由上海中医药大学实验动物中心提供的2月龄雄性清洁级SD (Sprauge-Dawley)大鼠共24只，SPF级，体重(160±20)g，适应性饲养1周后，随机分为正常组8只、自然衰老组8只、艾灸组8只。

    1.2 主要试剂与仪器

    Rb原位杂交试剂盒、P53原位杂交试剂盒、Bcl-2原位杂交试剂盒、PKC原位杂交试剂盒、羊抗兔SABC试剂盒、羊抗小鼠SABC试剂盒、兔抗大鼠Rb多克隆抗体、小鼠抗大鼠P53单克隆抗体、小鼠抗大鼠Bcl-2单克隆抗体、小鼠抗大鼠蛋白酶C单克隆抗体、DAB显色试剂盒等选用武汉博士德生物工程有限公司产品；仪器包括恒温杂交炉(OLS 200)、显微镜(OLYMPUS BH2)、Motic图像分析系统(麦克奥迪实业集团有限公司)。

    1.3 造模方法

    SD大鼠适应性饲养1周后，在SPF级环境设施中正常饲养20个月，待其自然进入衰老期[4]。

    1.4 分组与处理

    正常组：正常情况下饲养9周。

    自然衰老组：正常情况下饲养20个月。

    艾灸组：温和灸肾俞穴[3]，每日1次，每次5分钟，5次为一疗程，每疗程结束后休息2天，再进行下一疗程，共治疗20个月。

    1.5 标本采集

    实验结束后处死各组大鼠，摘取肝脏，分别置于液氮或10%中性甲醛固定液中保存备用。

    1.6 检测指标与方法

    1.6.1 原位杂交方法检测大鼠肝组织Rb、P53、Bcl-2、PKC mRNA的表达

    原位杂交探针由复旦科技有限公司合成。引物序列、探针长度见表1。Rb、P53、Bcl-2、PKC mRNA原位杂交检测按试剂盒说明书进行。

    阴性对照：以预杂交液代替杂交液，并完成整个过程 ......