张玉 邵建国 陈琳 卞兆连 刁花玉 达坤林

    季德胜蛇药通过调控miR-335抑制肝癌Huh-7细胞增殖作用机制探讨

    张玉 邵建国 陈琳 卞兆连 刁花玉 达坤林

    目的 探讨季德胜蛇药对肝癌Huh-7细胞增殖作用的影响并进一步从miRNA层面探讨其抑制增殖的调控机制。方法 以肝癌Huh-7细胞为模型，制备不同浓度的兔含药血清后培养Huh-7细胞，并同时设置相应浓度的对照组。CCK-8实验检测转染miR-335入Huh-7细胞后对该细胞增殖能力的影响；采用实时定量聚合酶链式反应qRT-PCR检测季德胜蛇药含药血清对Huh-7细胞中miR-335的调控作用；CCK-8实验检测季德胜蛇药含药血清对Huh-7细胞增殖能力的影响；Western-blot检测miR-335潜在靶向Bcl-w表达水平的变化。结果 miR-335过表达后CCK-8实验组与空白对照组及阴性对照组相比，其OD值显著降低(P1 材料和方法

    1.1 实验动物

    6只中国大耳白兔，体质量(3.0±0.5) kg，购于南通大学动物房(许可证号：SYXK(苏)2012-0031)；实验动物饲料：白兔基础饲料，购买于南通大学动物房，实验期间各组实验白兔均服用自来水，自由饮食。

    1.2 人肝癌Huh-7细胞

    购于美国模式培养物集存库(ATCC)，由上海交通大学附属仁济医院实验室保种培养并友情提供。

    1.3 主要试剂与仪器

    季德胜蛇药:购买于南通市第三人民医院，产于南通精华制药集团股份有限公司，药品批号：21150612。DMEM高糖完全培养基:立菲生物有限公司；胎牛血清：Invitrogen公司；胰蛋白酶：Invitrogen公司；Mimics:上海吉玛制药技术有限公司；CCK-8试剂：上海同仁有限公司；RT-PCR试剂盒：广州复能基因有限公司；Bcl-w抗体：武汉三鹰生物技术有限公司；蛋白抽提及浓度测定试剂盒：上海碧云天有限公司；GeneAmp PCR System 9700、CFX Connect Real-time System、RT-6000酶标仪(深圳雷桂生命科学有限公司)；紫外/可见分光光度计(岛津)；细胞培养箱(南通银河生物科技有限公司)；25 cm2培养瓶、6孔板、96孔板(Corning公司)。

    1.4 兔含药血清的制备

    大耳白兔6只，分为正常对照组和蛇药组。蛇药组给药剂量为1540 mg/(kg·d)，剂量为正常成人标准体重的10倍，每天相同时间灌胃1次，每天给药总容量为10 mL/kg；另对照组给予相同容量的生理盐水灌胃 ......