吴梦丽 梁嘉俊 魏飞力 杨文龙 杜宇琼 张秋云

    慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)是在慢性肝病的基础上发生急性肝功能衰竭的一组临床综合征，病死率极高[1]。在中国，HBV-ACLF为其最常见类型[2]，且目前发病机制尚不明确。现多认为肝细胞大量死亡是ACLF的核心事件，同时伴肝细胞增殖障碍致其再生不足[3]。该病目前没有特异疗法，主要以支持治疗和肝移植为主[4]。但有研究显示ACLF发生时肝细胞可进行增殖并修复肝组织损伤[5]，通过调节肝细胞增殖，从而改善肝脏急性损伤是阻止ACLF进一步发展的关键途径之一[6]。而转录因子E2F1是调控细胞增殖的关键转录因子，能促使细胞从G1期向S期转换，加快细胞增殖进程[7]。本课题组前期动物实验发现截断逆挽方能抑制ACLF模型大鼠肝细胞的过度凋亡，促进肝细胞的代偿性增殖，极大地减轻并逆转ACLF模型大鼠肝细胞的损伤[8-10]。本研究在此基础上利用体外细胞实验进一步观察截断逆挽方含药血清调控E2F1介导的细胞增殖，减轻D-氨基半乳糖(D-Galactosamine，D-GlaN)诱导的人正常肝细胞LO2细胞损伤的作用机制。

    1 材料与方法

    1.1 细胞及动物

    LO2细胞，由首都医科大学中医药学院肝病实验室赠送。

    雄性Wistar大鼠20只，体重250～280 g，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2016-0006，饲养于首都医科大学实验动物科学部SPF级动物室。

    1.2 实验药物及试剂

    截断逆挽方组成：苦味叶下珠30 g、瓜蒌30 g、金钱草30 g、生黄芪30 g、槲寄生30 g、三七6 g、莪术6 g、丹参20 g、生地黄20 g、黑附片先煎15 g，购自于北京同仁堂中医医院药房，经国医大师金世元生药鉴定。在首都医科大学中医药学院实验中心水煎提取。根据前期实验结果[10]，确定中药组每只大鼠按照体重每日给予21.7 g/(kg·d)中药剂量效果最佳，水煎液浓缩成4.34 g/mL，盛装在灭菌玻璃瓶内，4℃冰箱冷藏备用，使用前热水浸泡，摇匀。

    DMEM高糖培养基(Hyclone，美国)、PBS(HyClone，美国)、胎牛血清(Excell Bio，澳洲)、Cell Counting Kit-8(cck8)(Dojindo，日本)、D-GlaN(Sigma，美国)。Real-time PCR相关试剂：RNApre Pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒(TIANGEN)、FastKing RT Kit(TIANGEN)、SuperReal PreMix Plus(TIANGEN)均购自于天根生化科技有限公司 ......