周敏 贾湘隆 徐旭英

    糖尿病足溃疡(diabetic foot ulcer，DFU)是糖尿病微血管并发症中最常见最严重的一种，多发生在糖尿病血管损伤致组织缺血、坏死、感染之后，发病后未及时规范治疗往往会使病情进行性加重[1]，致残致畸率极高，截肢(趾)术后5年病死率甚至高达50%～68%[2]。促进创面愈合是目前糖尿病足溃疡临床治疗与科学研究的重要着眼点，但现有的治疗方案往往起效慢且疗效不佳，急需安全有效的治疗手段促进创面愈合。创面修复的首要基础是血管新生带来的有效血氧供应，微血管内皮细胞通过多种方式参与血管新生及创面修复，改善糖尿病足溃疡微血管内皮细胞功能有助于治疗糖尿病足溃疡。回阳生肌膏是首都医科大学附属北京中医医院的一种外用制剂，在临床应用了数十年，已有研究对其促血管新生、促创面愈合的安全性及有效性进行了验证[3]，本研究对2018年12月至2019年6月间北京中医医院疮疡血管外科住院部的大腿截肢患者进行了标本采集，按课题组前期研究报道的人来源原代微血管内皮细胞的分离培养[4]，通过进行细胞学体外实验，探讨回阳生肌膏对人来源微血管内皮细胞的影响，以期进一步明确回阳生肌膏促进微血管新生、促创面愈合的机制。

    1 材料与方法

    1.1 标本来源

    实验标本均来自北京中医医院疮疡血管外科住院部2018年12月至2019年6月行大腿截肢患者，取大腿截肢后创面周围皮肤和截除大腿近心端皮肤的真皮层。本实验符合中华人民共和国国务院颁发的《医疗机构管理条例》，经过医院伦理委员会论证并同意通过，标本采集前充分告知患者实验方案并签署知情同意书。

    1.2 药物

    回阳生肌膏由首都医科大学附属北京中医医院疮疡血管外科提供，由肉桂、炮姜、人参、黄芪、当归、白芥子、白蔹等药物与凡士林调匀制成。龙珠软膏由武汉马应龙药业集团股份有限公司提供，批号：110301。

    1.3 人来源微血管内皮细胞分离与培养

    采集标本后立即放入含双抗的DMEM培养基中，分离原代微血管内皮细胞：PBS冲洗组织3次，于DMEM培养基中将组织修剪成 1 mm3大小，转移至预湿培养皿，37℃、5% CO2细胞培养箱内静置2小时，加入含20%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM培养基继续培养60小时，去除组织块并更换培养基，纯化细胞：滴3滴胰酶，10秒后吸弃旧培养基，加新培养基，每日1次换液，待细胞铺满单层后冻存或用于后续实验。原代微血管内皮细胞培养：细胞生长培养基由 90%1640培养基、5%内皮细胞生长添加物(endothelial cell growth supplement ......