张鹤 刘雪梅 曾子修 刘晓汉 张昕洋 田杨 徐榛敏 张允岭

    能量代谢紊乱被认为是脑梗死急性期主要病理机制之一,脑缺血是线粒体损伤的重要因素,线粒体作为细胞代谢的重要场所,其损伤主要体现在ATP合成减少、氧化损伤及钙离子稳态失调等,这些损伤共同作用诱导线粒体通透性改变,从而诱发神经元的凋亡[1-2]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是细胞能量感应分子,具有感知细胞能量状态的功能,可调节细胞的新陈代谢、周期进程及细胞生长[3]。研究表明[4-5],mTOR通过雌激素相关受体 α(estrogenrelated receptor α,ERRα) 可 调控谷氨酰 胺酶(glutaminase,GlS),从而影响线粒体谷氨酰胺的回补代谢,为三羧酸循环(tricarboxylic acid,TCA)和脂质合成等能量代谢提供一定的物质基础。

    苦碟子注射液具有活血止痛、清热祛瘀的功效。临床研究发现[6],苦碟子注射液对脑梗死急性期血瘀证兼热证或热证均具有良好的临床效果；注射用血栓通具有活血祛瘀、通脉活络的功效。二药目前都已是上市的临床一线用药,单独使用治疗脑梗死均有一定的疗效,二药联合治疗脑梗死是否可起到协同增效的目的及其作用机制仍不明确。因此,在本次研究中,借助大鼠大脑中动脉阻塞脑梗死(middle cerebral artery occlusion rats,MCAO)模型,从mTOR-ERRα-GLS信号通路的角度探讨清热活血中药联用(苦碟子注射液+注射用血栓通)的协同增效作用及其机制。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物

    SPF级雄性SD大鼠95只,体重(200±20)g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号：SCXK(京)2016-0006。大鼠饲养于北京中医药大学东方医院动物实验中心,室温22～25℃,湿度40%～60%,12小时昼夜交替。本次实验经过东方医院实验动物伦理委员会批准。

    1.2 药物与试剂

    苦碟子注射液(通化华夏药业有限责任公司,Z20025450)；注射用血栓通(冻干)(广西梧州制药(集团)股份有限公司,15030509)；2,3,5-三苯基氯化四氮唑(Sigma,T8877)；蛋白提取液(天德悦生物科技有限公司,WB0028)；BCA蛋白浓度测定套装(天德悦生物科技有限公司,WB0028)；SDS-PAGE预制胶套装(北京百奥思科生物医学技术有限公司,MD911919)；蛋白上样buffer(Amresco,0332)；封闭液(Proteintech B400040)；电泳液(北京百奥思科生物医学技术有限公司,MD6620)；转膜液(北京百奥思科生物医学技术有限公司,MD6621)；中等蛋白分子量 marker(Thermo,26617)；酶标二抗羊抗鼠(北京百奥思科生物医学技术有限公司,MD2142)；酶标二抗羊抗兔(天德悦生物科技有限公司S004)；Anti-Glutaminase antibody(Abcam,Ab93434)；mTOR Antibody(Thermo Fisher,2972)；Anti-Estrogen Related Receptor alpha antibody(Abcam,Ab76288) ......