姜心航 张荣 刘绍能 马继征 丁佳媛 刘慧敏 张玲 路迎冬

    肝窦毛细血管化是肝纤维化和肝硬化的基本病理改变,一方面导致肝细胞与血液物质交换障碍,另一方面促进细胞外基质(extracellular matrix,ECM)大量沉积,加重肝纤维化[1]。因此,抑制肝窦毛细血管化的发生,对延缓肝纤维化发展有重要意义。芪术颗粒由黄芪、白术、柴胡、茵陈、丹参、莪术等药组成,具有益气健脾、化瘀通络、利湿解毒之功效,是我院治疗肝纤维化的有效药物,临床应用已有30余年。以往实验研究证实,该药对肝纤维化模型大鼠有良好的防治效果[2-3]。本研究建立肝纤维化模型基础上分离肝窦内皮细胞,结合电子显微镜技术,从细胞、分子水平上观察芪术颗粒对肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells,LSECs)窗孔、表型及其毛细血管化的影响及机制,以进一步阐明该药抗纤维化的作用机制。

    1 材料与方法

    1.1 实验动物

    70只雄性Wistar大鼠,体质量180～200 g,清洁Ⅱ级,由军事医学科学院(中国北京)实验动物中心提供。这些大鼠被关在笼中,在环境控制室内(20±2℃,相对湿度36%)进行12小时的光/暗循环,允许自由获取食物和水,用标准合成饲料喂养,所有研究方案均经中国中医科学院广安门医院动物伦理委员会批准,伦理委员会受理编号为:IACUC-GAMH-2020-003。

    1.2 药物

    芪术颗粒(文件号:京药制字Z20063189)由中国中医药研究院广安门医院制剂室(中国北京)制备并提供,曾被列为国家“九·五”攻关项目(项目编号96-906-08-03),后又列为国家”十·五”攻关项目(项目编号2001BA701A-24)。芪术颗粒组成:黄芪15 g、莪术9 g、白术15 g、丹参15 g、桃仁10 g、茵陈15 g、郁金10 g、柴胡10 g、北豆根10 g、甘草6 g,临床用量为每次6 g,每日2次,每日总剂量12 g。动物和人类每千克体重的剂量换算系数为6.25(参考史新友编辑的《现代医学实验动物学》),大鼠的剂量为1.25 g/(Kg·d)。

    1.3 试剂

    四氯化碳(CCl4):分析纯,北京化学试剂公司。CCl4(阿拉丁生物,C112041-500mL);橄榄油(分析纯,北京化学试剂公司)。整合素αVβ3(integrin αVβ3,ITGαVβ3)(Abcam,ab52939);台盼蓝染色试剂盒(Beyotime,C0011);肝窦内皮细胞1抗体(hepatic sinusoidal endothelial cells antibody,SE-1)试剂(NOVUS,NB110-68095SS);血小板—内皮细胞黏附分子(platelet endothelial cell adhesion molecule-1,CD31)试剂(Affinity,AF6191);无水乙醇、二甲苯、盐酸、氨水、中性胶(国药集团化学试剂有限公司,中国)、Masson染色试剂盒(Solaibao,G1340-7,中国北京)、甲苯氨蓝染色溶液(谷歌生物科技,G1032,中国武汉) ......