王南丁 陈晋玉 李成龙 胡乔斌 雷瑗琳 张莎 李哲

    研究表明,发生急性冠状动脉综合征(acute coronary syndromes,ACS)的关键因素是不稳定斑块破裂或糜烂,诱发急性血栓形成[1],所以干预这一环节对临床防治ACS 至关重要,其中氧化低密度脂蛋白(oxidized low densitylipoprotein,ox-LDL)被巨噬细胞摄取,泡沫细胞的形成是不稳定斑块发生的关键因素[2-3]。 充分的研究证据证实炎症机制在不稳定斑块的发生、发展过程中扮演着至关重要的作用,其中大量的研究数据表明NLRP3 炎症小体在动脉粥样硬化进展过程中发挥重要作用[4]。 芪丹通脉片是课题组在总结长期使用益气活血法治疗动脉粥样硬化、缺血性心脏病的临床经验中形成的中药复方,2001 年获得新药证书和药品注册批件(国药准字:Z20090252)。 课题组前期基础证明芪丹通脉片具有抗炎、稳定斑块的作用[5-6],本实验通过研究益气活血配伍复方芪丹通脉片对巨噬细胞泡沫化过程及其进程中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLR pyrin domain containing 3,NLRP3)炎症小体、下游炎性因子白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)的影响,以深入探究其抗动脉硬化的作用靶点。

    1 材料和方法

    1.1 细胞株与动物

    RAW264.7 小鼠单核巨噬细胞株,购自武汉巴菲尔生物技术服务有限公司;雄性SD 大鼠8 只,6周龄,体质量为(280±20)g,购自空军军医大学动物实验 中心。 适应 性饲 养 1 周 ( 合 格 证 号:11400700180466)。

    1.2 药物、试剂与仪器

    芪丹通脉片浸膏干粉(黄芪30 g、丹参30 g、当归15 g、红花30 g、桂枝10 g),取红花于 60℃以下烘干,粉碎; 取丹参醇提后再浓缩成浸膏; 取炙黄芪等三味药材和剩余量红花粗粉及丹参药渣用水煎煮两次,合并二次煎液,浓缩成浸膏。 将红花细粉与水提浸膏及醇提浸膏混合均匀,60℃以下烘干,再粉碎成细粉。 其余各组药物浸膏制备与芪丹通脉片制备工艺大体相同。 1 g 芪丹通脉片浸膏干粉相当于生药2.86 g[7]。

    酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法试剂盒:白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司, 货号:E-EL-M0037c、E-EL-M0730c;CCK-8 (cell counting kit-8)试剂盒购自东仁化学科技有限公司,货号:CK04;BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天,货号:12658;兔多抗NLRP3 购自武汉三鹰,货号:9771-1-AP;兔多抗半胱氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)购自英国Abcam 公司,货号:ab62698;兔多抗磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)购自杭州贤至生物科技有限公司,货号:AB-P-R001;引物合成购自北京擎科新业生物技术有限公司;Trizol 购自中国Aidlab 生物技术有限公司,货号:15596-018);逆转录试剂盒购自美国GeneCopoeia 公司,货号:QP070 ......