胆固醇衍生物阳离子脂质体复合EGFP-IL-1Ra质粒体外转染HELA细胞系的研究(2)
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1 材料与方法
1.1 胆固醇衍生物脂质体制作过程
(1)卵黄磷酸卵磷脂和胆固醇衍生物按照摩尔比例1∶1混合；(2)用氯仿溶解后在旋转蒸馏瓶内蒸馏1～2 h，待形成贴壁的薄膜；(3)放入真空抽气机中真空抽吸4 h；(4)瓶中加入0.15 mol PBS(pH 7.4)充分溶解；(5)将VC130超声探针插入溶液中，最大功率输出，在氮气保护下用超声震荡10 min(开启30 s，停止30 s/循环)。放入冰水中降温，防止脂质体降解；(6)最终脂质体的浓度为0.1 mmol；(7)用100 000 g 速度离心除去未形成脂质体的脂类；(8)调整其pH 值到7.0。
1.2 体外凝胶阻滞试验
将阳离子脂质体与质粒DNA 按脂质体/DNA 质量比为500∶1，200∶1，150∶1，100∶1，50∶1，20∶1，10∶1，5∶1，1∶1，1∶5，1∶10， 1∶20比例进行试验。不同质量比形成的离子脂质体-DNA复合物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，每孔上样量为0.5 μg DNA。电泳40 min后用溴化乙锭(EB)染色，紫外灯下观察以确定阳离子脂质体与质粒DNA的配比关系。在照胶仪上将照片拍摄存储。
1.3 MTT法检测脂质体细胞毒性
1.3.1 MTT检测 铺板后48 h进行MTT检测，具体操作步骤如下：将冷冻保存的MTT储存液取出，融化后用培养基稀释10倍(1 mL MTT储备液与9 mL培养液混匀)，最终浓度为0.5 mg/mL。取出待测细胞培养板(96孔板)，将培养板倒置弃去培养液(100 μL/孔)，然后放在5%CO2 37℃孵箱中孵育4 h。取出后倒置培养板，弃去MTT使用液，加入酸化异丙醇并摇荡。待颗粒完全溶解后用酶标仪测定波长545 nm/570 nm(参考波长630 nm)处吸光值。结果与分析：用各受试浓度组的吸光度值与对照组相比得出的百分率作为各受试物浓度组的细胞存活率，通过设计合理的一系列剂量得出的细胞存活率可计算受试物的IC50，比较不同受试物的IC50可知细胞对受试物的敏感性。Lipofect2000脂质体作为对照。
1.3.2 细胞铺板 HELA细胞分别用含有10%胎牛血清的DM EM培养基进行常规培养。每个孔内加入0.5 μL混合好的转染溶液(每孔含有0.5 μg EGFP-IL-1Ra质粒)，对照组中每个孔内加入2 μL(0.5 μg)的单纯EGFP-IL-1Ra质粒。37℃，5%CO2孵箱中培养5 h后移去介质，用PBS冲洗细胞2次，加入含有10%胎牛血清的培养基培养48 h。
1.4 转染效率检测
转染色后48 h在荧光显微镜下检测各个组情况。将转染细胞放在激发波长为 488 nm的荧光显微镜下观测EGFP-IL-1Ra质粒的表达，以100倍显微镜视野为标准，计5个显微镜视野内表达绿色荧光的细胞数，求平均值以此评价转染效率。
1.5 统计分析
采用SPSS 12.0软件进行统计学分析，进行t检验，P < 0.01设定为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 细胞毒性检测
MTT 结果表明，实验中所用脂质体的IC50 为650 μg/mL，而对照组脂质体的IC50为600 μg/mL。本实验中新型阳离子脂质体具有较低的细胞毒性(图1)。
2.2 体外凝胶阻滞试验
将脂质体/DNA按照500∶1，200∶1，150∶1，100∶1，50∶1，20∶1，10∶1，5∶1，1∶1，1∶5，1∶10，1∶20比例进行试验。结果表明，在脂质体/DNA 质量比为500∶1，200∶1，150∶1，100∶1，50∶1时，胶槽内没有和EB结合的DNA，也没有条带出现，说明在以上比例下脂质体可以牢牢的包裹住DNA。随着脂质体所占比例的降低和DNA比例的升高，脂质体包裹吸附DNA的能力降低，可见条带逐渐清晰，亮度逐渐增高(图2)，说明游离DNA逐渐增多。因此我们选用脂质体/DNA 质量比为50∶1作为最适比例进行体外转染。
2.3 荧光显微镜观察
脂质体结合EGFP-IL-1Ra质粒转染 HELA细胞48 h后可见有荧光蛋白表达，荧光强度高于单纯EGFP-IL-1Ra质粒转染组。通过计数100倍视野下阳性表达细胞的数量也发现脂质体组多于单纯质粒转染组(图3)。
3 讨论
基因工程最终要应用到临床需要有两个重要的条件：第一是有高效率的基因载体将所需基因转染到要表达的部位。质粒、病毒、脂质体等都是这样的载体。第二是这些载体必须具有无毒或低毒性、无免疫原性等特点，不能对人体产生不良影响并且不牵涉伦理道德问题。目前所有这些载体中病毒的转染效率最高，但由于其副作用较多，因此临床应用前景不甚理想。研究表明脂质体毒副作用少，虽然其转染效率与病毒相比还存在一定差距，但是通过对其化学物理成分的改进可以有效地提高其转染效率，同时由于脂质体具有较好的体内相容性，因此成为基因转染中的理想载体之一。目前对脂质体的研究主要集中在对辅助基团的修饰改造方面。通过改造可以使脂质体携带正电荷以结合更多DNA同时通过改进脂溶性也可以增加进入细胞内的数量，从而提高转染效率。胆固醇是许多天然生物膜的重要成分，本身并不形成膜结构，但是能够以1∶1甚至2∶1的摩尔比插入磷脂膜中。加入胆固醇可以改变脂膜的相变，增加其稳定性。目前关于脂质体的研究中具有胆固醇衍生物辅助基团的脂质体复合物占有相当大的比例[8-10] ......
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