内质网源性转录因子对间歇性低氧大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响(1)
[摘要]目的 研究内质网源性转录因子(CHOP)对间歇性低氧大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响。方法 54只大鼠随机分为三组：假手术组(n=18)、缺血再灌注组(n=18)、间歇性低氧+缺血再灌注组(n=18)。通过球囊结扎冠状动脉方法制作心肌缺血再灌注动物模型，将老鼠暴露在低氧循环中。制作间隙性低氧动物模型，用TUNEL法检测心肌细胞的凋亡，术后Western blot法检测CHOP蛋白表达。结果 假手术组、缺血再灌注组及间歇性低氧+缺血再灌注组的心肌细胞凋亡率分别为(4.16±2.27)%、(38.68±4.58)%、(18.72±6.71)%，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)；假手术组、缺血再灌注组及间歇性低氧+缺血再灌注组的CHOP蛋白表达分别为(1.612±0.284)%、(0.946±0.372)%、(0.547±1.429)%，组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 间歇性低氧在大鼠心肌缺血损伤中具有保护心脏的作用，其保护机制与CHOP蛋白表达下降有关。
[关键词]内质网源性转录因子；间歇性低氧；缺血再灌注
[中图分类号] R692.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2016)08(c)-0145-03
低氧是心肌缺血的主要因素，在缺血性心脏疾病中有重要的作用。低氧损伤的严重程度除了与低氧刺激的强度和持续时间有关，同时与心脏对低氧的耐受性有关[1-2]。因此，增加心脏对缺血、缺氧的耐受性来达到心脏保护的目的，一直是基础和临床医学研究关注的热点之一。本实验在研究间歇性低氧状态下，内质网源性转录因子(CHOP)表达对心肌缺血再灌注损伤的作用机制。现报道如下。
1材料与方法
1.1实验动物及试剂材料
取8～10周左右雄性SD大鼠54只，体重(200±20)g，由南昌大学动物实验中心提供。TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒(武汉博士德公司)；蛋白浓度测定标准品(普利莱公司)；兔抗大鼠CHOP抗体(美国Bioword公司)，碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗兔IgG(美国Santacruz公司)，BX41型光学显微镜(日本奥林巴斯株式会社)。
1.2动物分组及模型建立
将实验动物分为三组。
假手术组(n=18)：含氧量正常者作为假手术组[3]，丝线穿过冠状动脉左室支但不结扎，经尾静脉注射生理盐水。
缺血再灌注组(n=18)：参考赵秀梅等[4]的垫扎球囊法，采用气管插管、人工呼吸、开胸、冠状动脉左前降支上垫扎充水球囊阻断血流的方法造成心肌缺血，通过塌陷气囊进行心肌再灌注，复制并制作大鼠缺血再灌注模型。
间歇性低氧+缺血再灌注组(n=18)：将大鼠暴露在每日4次的低氧循环中(每次接受2 min 6%～8%低氧，3 min氧和处理，循环5次)，处理14 d，制作间歇性低氧模型。建立间歇性低氧动物模型后，再制作缺血再灌注模型。
1.3 TUNEL法检测心肌细胞凋亡
通过末端缺口标记技术(terminal deoxy-nucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)测定凋亡细胞。试验结束后将心肌组织石蜡切片，按TUNEL试剂盒说明书标记染色。未凋亡的细胞核为深蓝色，凋亡的细胞核为棕黄色。在高倍镜下随机选择10个视野，每个视野中选100个细胞，统计阳性细胞数。将阳性细胞数相加，计算阳性细胞百分率。
1.4 Western blot法检测CHOP蛋白表达
制模结束后处死手术处理后的存活大鼠。采用Western blot方法测定CHOP蛋白，提取各组心肌组织，采用考马斯亮蓝测定蛋白质定量。蛋白变性后，将含有20 μg蛋白的样本进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，再将凝胶上的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，封闭液封闭，用特异性CHOP抗体孵育，4℃过夜，然后与辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，增强化学发光法显色[4]。以β-actin作为蛋白质完整性及等量的对照。
1.5统计学分析
采用统计软件SPSS 15.0对实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，多组间比较应用单因素方差分析，组间两两比较应用q检验。非正态分布数据经校对转换为正态数据后进行统计。计数资料以率表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1各组大鼠心肌细胞凋亡率的比较
TUNEL法检测显示，凋亡心肌细胞核为棕黄色，染色质凝聚、浓缩，而正常心肌细胞的核染为蓝色。假手术组凋亡的细胞极少；缺血再灌注组见一定量的凋亡细胞；间歇性低氧+缺血再灌注组可见少量凋亡细胞，各组大鼠心肌细胞凋亡率为(4.16±2.27)%、(38.68±4.58)%、(18.72±6.71)%，各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。
2.2各组心肌组织CHOP蛋白表达的比较
Western blot法检测各组心肌组织CHOP蛋白水平，假手术组、缺血再灌注组、间歇性低氧+缺血再灌注组CHOP蛋白表达分别为(0.162±0.284)、(0.946±0.372)、(0.547 ±1.429)，与假手术组比较，间歇性低氧组CHOP蛋白表达明显下降(P<0.05)；与缺血再灌注组比较，间歇性低氧组CHOP蛋白表达明显下降(P<0.05)；与假手术组比较，间歇性低氧+缺血再灌注组CHOP组蛋白表达升高(P<0.05)。
3讨论
心肌缺血再灌注损伤指在短时间心肌血液供应中断，一定时间内恢复血供，原缺血心肌发生更严重的损伤。早期流行病学调查和动物实验发现，低氧适应可以增加心脏对缺血缺氧损伤的保护作用[5-9]，然而目前间歇性低氧的心肌保护作用机制的研究还是非常匮乏。 (王媛媛 曹建 万建华)
[关键词]内质网源性转录因子；间歇性低氧；缺血再灌注
[中图分类号] R692.5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2016)08(c)-0145-03
低氧是心肌缺血的主要因素，在缺血性心脏疾病中有重要的作用。低氧损伤的严重程度除了与低氧刺激的强度和持续时间有关，同时与心脏对低氧的耐受性有关[1-2]。因此，增加心脏对缺血、缺氧的耐受性来达到心脏保护的目的，一直是基础和临床医学研究关注的热点之一。本实验在研究间歇性低氧状态下，内质网源性转录因子(CHOP)表达对心肌缺血再灌注损伤的作用机制。现报道如下。
1材料与方法
1.1实验动物及试剂材料
取8～10周左右雄性SD大鼠54只，体重(200±20)g，由南昌大学动物实验中心提供。TUNEL法细胞凋亡检测试剂盒(武汉博士德公司)；蛋白浓度测定标准品(普利莱公司)；兔抗大鼠CHOP抗体(美国Bioword公司)，碱性磷酸酶(AP)标记的羊抗兔IgG(美国Santacruz公司)，BX41型光学显微镜(日本奥林巴斯株式会社)。
1.2动物分组及模型建立
将实验动物分为三组。
假手术组(n=18)：含氧量正常者作为假手术组[3]，丝线穿过冠状动脉左室支但不结扎，经尾静脉注射生理盐水。
缺血再灌注组(n=18)：参考赵秀梅等[4]的垫扎球囊法，采用气管插管、人工呼吸、开胸、冠状动脉左前降支上垫扎充水球囊阻断血流的方法造成心肌缺血，通过塌陷气囊进行心肌再灌注，复制并制作大鼠缺血再灌注模型。
间歇性低氧+缺血再灌注组(n=18)：将大鼠暴露在每日4次的低氧循环中(每次接受2 min 6%～8%低氧，3 min氧和处理，循环5次)，处理14 d，制作间歇性低氧模型。建立间歇性低氧动物模型后，再制作缺血再灌注模型。
1.3 TUNEL法检测心肌细胞凋亡
通过末端缺口标记技术(terminal deoxy-nucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)测定凋亡细胞。试验结束后将心肌组织石蜡切片，按TUNEL试剂盒说明书标记染色。未凋亡的细胞核为深蓝色，凋亡的细胞核为棕黄色。在高倍镜下随机选择10个视野，每个视野中选100个细胞，统计阳性细胞数。将阳性细胞数相加，计算阳性细胞百分率。
1.4 Western blot法检测CHOP蛋白表达
制模结束后处死手术处理后的存活大鼠。采用Western blot方法测定CHOP蛋白，提取各组心肌组织，采用考马斯亮蓝测定蛋白质定量。蛋白变性后，将含有20 μg蛋白的样本进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，再将凝胶上的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，封闭液封闭，用特异性CHOP抗体孵育，4℃过夜，然后与辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，增强化学发光法显色[4]。以β-actin作为蛋白质完整性及等量的对照。
1.5统计学分析
采用统计软件SPSS 15.0对实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，多组间比较应用单因素方差分析，组间两两比较应用q检验。非正态分布数据经校对转换为正态数据后进行统计。计数资料以率表示，采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1各组大鼠心肌细胞凋亡率的比较
TUNEL法检测显示，凋亡心肌细胞核为棕黄色，染色质凝聚、浓缩，而正常心肌细胞的核染为蓝色。假手术组凋亡的细胞极少；缺血再灌注组见一定量的凋亡细胞；间歇性低氧+缺血再灌注组可见少量凋亡细胞，各组大鼠心肌细胞凋亡率为(4.16±2.27)%、(38.68±4.58)%、(18.72±6.71)%，各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。
2.2各组心肌组织CHOP蛋白表达的比较
Western blot法检测各组心肌组织CHOP蛋白水平，假手术组、缺血再灌注组、间歇性低氧+缺血再灌注组CHOP蛋白表达分别为(0.162±0.284)、(0.946±0.372)、(0.547 ±1.429)，与假手术组比较，间歇性低氧组CHOP蛋白表达明显下降(P<0.05)；与缺血再灌注组比较，间歇性低氧组CHOP蛋白表达明显下降(P<0.05)；与假手术组比较，间歇性低氧+缺血再灌注组CHOP组蛋白表达升高(P<0.05)。
3讨论
心肌缺血再灌注损伤指在短时间心肌血液供应中断，一定时间内恢复血供，原缺血心肌发生更严重的损伤。早期流行病学调查和动物实验发现，低氧适应可以增加心脏对缺血缺氧损伤的保护作用[5-9]，然而目前间歇性低氧的心肌保护作用机制的研究还是非常匮乏。 (王媛媛 曹建 万建华)