实时荧光定量聚合酶链反应法监测慢性髓系白血病外周血 BCR-ABL 融合基因水平的价值研究(2)
1.2.2检测方法与步骤 采用qRT-PCR法检测患者的BCR -ABL转录本水平,具体步骤如下。①RNA提取:抽取患者空腹静脉血5 ml置于EDTAK2抗凝管中,混匀,加入人淋巴细胞分离液分离白细胞,加入TRhol试剂裂解白细胞,经氯仿萃取出核酸,并利用异丙醇沉淀提取RNA。②RT-PCR反应:将RNA反应管、DEPC-H20反应管、对照品和标准品反应管置于qRT-PCR仪中进行扩增,循环参数:45℃,20 min;95℃,5 min;95℃,15 s;58℃,60 s;循环45次。设立阳性对照和阴性对照,内参基采用ABL。③计算标准曲线:利用标准品qRT-PCR反应扩增的结果制作出标准曲线。④计算样本BCR-ABL水平:通过样本Ct值和标准曲线计算出样本起始BCR-ABL值和ABL值,选取ABL≤38的样本,根据以下公式计算BCR-ABL水平。BCR-ABL(%)=(BCR-ABL拷贝数/ ABL拷贝数)×100%。上述各项操作和步骤均按照仪器和试剂盒说明严格规范操作 ......
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