郝一楠 张静静 郭冰峰 王明华 王亚萍 王 斌

    1.华兰生物工程股份有限公司研发中心，河南新乡 453003；2.华兰生物工程股份有限公司血制研发部，河南新乡 453003；3.华兰基因工程有限公司质量控制部，河南新乡 453000

    肺炎链球菌是一种能够引起严重的脑膜炎、败血症、大叶性肺炎、支气管炎、鼻窦炎和急性中耳炎等疾病的病原菌，在世界范围内引发很高的发病率和死亡率，可以感染儿童和成人，因此预防和控制肺炎球菌性疾病对人类的健康和生命安全至关重要[1-3]。荚膜多糖(CPS)是肺炎球菌重要的毒力因子，暴露于细菌表面，具有免疫原性，能够诱发宿主的免疫应答反应，因此预防用肺炎链球菌疫苗的生产大多使用肺炎链球菌荚膜多糖[4-6]。为保证多糖疫苗生产批次的均一性和稳定性，合适的菌种保存方法显得至关重要。本研究选择在国内较为常见的肺炎链球菌血清型之一——4型进行研究，通过比较冻干前和冻干后的菌种活性来考察不同保护剂对肺炎链球菌菌种存活率的影响，分析该保护剂下菌种的遗传稳定性以及生长特性，现报道如下。

    1 材料与方法

    1.1 实验菌种

    肺炎链球菌4型菌种来源于中国医学细菌保藏管理中心(CMCC)，编号为31446菌株；肺炎链球菌6A型来源于ATCC，编号为BAA- 659；肺炎链球菌18C型CMCC，编号为 31687；肺炎链球菌19F型CMCC，编号为31692。

    1.2 主要试剂及仪器

    胰蛋白大豆琼脂、酵母粉、胰蛋白胨、蛋白胨、脱脂奶粉均购自美国BD公司；琼脂粉购自北京奥博星公司；海藻糖、谷氨酸钠均购自国药集团药业股份有限公司；生物安全柜购自苏州安泰空气技术有限公司；二氧化碳培养箱购自力康生物医疗科技控股有限公司；生物显微镜购自奥林巴斯公司；冻干机购自爱德华天利有限公司。

    1.3 菌悬液制备

    将菌株接种至5%羊血固体培养基，在二氧化碳培养箱中36.5℃、CO2浓度5%～10%条件下复苏培养18～24 h后传代扩增，将铺满固体培养基表面的菌苔刮取至0.85%氯化钠溶液中，混匀，即为菌悬液。

    1.4 含不同冻干保护剂的菌悬液制备

    根据文献报道[7-10]，选择菌种保藏常用的保护剂成分即A脱脂奶粉、B海藻糖、C谷氨酸钠三种成分为3因素。调整3个水平不同浓度正交试验 ......