混合酶消化法大鼠颅盖骨细胞的原代培养和鉴定(2)
参见附件。
1.2.3 原代成骨细胞的鉴定 (1)细胞形态学观察：在倒置显微镜下观察细胞形态结构。(2)ALP(碱性磷酸酶)染色：采用偶氮偶联法。取制备好的密度适中的细胞爬片，用固定液固定约3 min左右，再加入底物应用液避光37 ℃孵育15 min，水洗，采用苏木素进行复染，水洗，镜检。(3)Ⅰ型胶原免疫组化(SABC法)：多聚甲醛固定30 min后，水洗，去离子水孵育10 min；滴加山羊血清工作液，室温孵育15 min，甩去多余液体，勿洗；滴加兔抗大鼠的Ⅰ型胶原抗体，37 ℃孵育2～3 h，水洗；加入“二抗”，室温孵育20 min；滴加SABC试剂，室温孵育20 min，水洗；采用DAB试剂盒显色；苏木素轻度复染。
1.2.4 细胞生长曲线的绘制 取第二代成骨细胞，以3万/孔定量接种于24孔板中，每日取出24孔板中的3孔进行计数，计数8 d，绘制出混合酶消化法所获得的原代成骨细胞生长曲线。
2 结果
2.1 细胞形态学观察 原代培养的大鼠颅盖骨细胞有典型的成骨细胞特征，细胞贴壁生长，呈鳞片状，体积较大，胞浆丰富，多为单核，呈“铺路石样”排列，胞浆向外伸展，并伸出突触。见图1、图2。
2.2 碱性磷酸酶染色结果 细胞采用偶氮偶联法染色显示，细胞核呈蓝紫色，胞浆中有咖啡色颗粒，有少量颗粒分散在细胞周围，显示为阳性反应，说明所培养细胞具有分泌ALP的功能，符合成骨细胞特征。见图3。
2.3 Ⅰ型胶原免疫组化结果 免疫组化染色结果阳性，胞浆被染成棕黄色，符合成骨细胞特征。见图4。
2.4 细胞生长曲线结果 细胞传代后第4～5 d达到对数生长期。见图5。
3 讨论
3.1 成骨细胞的来源、分离与培养 成骨细胞的来源可分为细胞株和原代培养。目前已经建系的骨细胞株种类较少，而且细胞株在不断的传代过程中，骨细胞的某些生物学特性会发生变化，从而影响实验结果的准确性。另外，有些细胞株对生长条件的要求比较高，在购买运输的过程中细胞的活性会受到影响，导致购买的成骨细胞不易成活。而原代培养，由于其生物学性状尚未发生很大改变，故成骨细胞的原代培养，仍是目前进行成骨细胞体外实验的主要方法[1]。原代成骨细胞的组织来源上多采用兔，乳鼠等的颅盖骨或者大腿骨进行成骨细胞的分离、培养，也有采用动物下颌骨或人髂骨作为组织来源的。有研究表明[2],成熟大鼠颅盖骨细胞状态稳定 ......
1.2.3 原代成骨细胞的鉴定 (1)细胞形态学观察：在倒置显微镜下观察细胞形态结构。(2)ALP(碱性磷酸酶)染色：采用偶氮偶联法。取制备好的密度适中的细胞爬片，用固定液固定约3 min左右，再加入底物应用液避光37 ℃孵育15 min，水洗，采用苏木素进行复染，水洗，镜检。(3)Ⅰ型胶原免疫组化(SABC法)：多聚甲醛固定30 min后，水洗，去离子水孵育10 min；滴加山羊血清工作液，室温孵育15 min，甩去多余液体，勿洗；滴加兔抗大鼠的Ⅰ型胶原抗体，37 ℃孵育2～3 h，水洗；加入“二抗”，室温孵育20 min；滴加SABC试剂，室温孵育20 min，水洗；采用DAB试剂盒显色；苏木素轻度复染。
1.2.4 细胞生长曲线的绘制 取第二代成骨细胞，以3万/孔定量接种于24孔板中，每日取出24孔板中的3孔进行计数，计数8 d，绘制出混合酶消化法所获得的原代成骨细胞生长曲线。
2 结果
2.1 细胞形态学观察 原代培养的大鼠颅盖骨细胞有典型的成骨细胞特征，细胞贴壁生长，呈鳞片状，体积较大，胞浆丰富，多为单核，呈“铺路石样”排列，胞浆向外伸展，并伸出突触。见图1、图2。
2.2 碱性磷酸酶染色结果 细胞采用偶氮偶联法染色显示，细胞核呈蓝紫色，胞浆中有咖啡色颗粒，有少量颗粒分散在细胞周围，显示为阳性反应，说明所培养细胞具有分泌ALP的功能，符合成骨细胞特征。见图3。
2.3 Ⅰ型胶原免疫组化结果 免疫组化染色结果阳性，胞浆被染成棕黄色，符合成骨细胞特征。见图4。
2.4 细胞生长曲线结果 细胞传代后第4～5 d达到对数生长期。见图5。
3 讨论
3.1 成骨细胞的来源、分离与培养 成骨细胞的来源可分为细胞株和原代培养。目前已经建系的骨细胞株种类较少，而且细胞株在不断的传代过程中，骨细胞的某些生物学特性会发生变化，从而影响实验结果的准确性。另外，有些细胞株对生长条件的要求比较高，在购买运输的过程中细胞的活性会受到影响，导致购买的成骨细胞不易成活。而原代培养，由于其生物学性状尚未发生很大改变，故成骨细胞的原代培养，仍是目前进行成骨细胞体外实验的主要方法[1]。原代成骨细胞的组织来源上多采用兔，乳鼠等的颅盖骨或者大腿骨进行成骨细胞的分离、培养，也有采用动物下颌骨或人髂骨作为组织来源的。有研究表明[2],成熟大鼠颅盖骨细胞状态稳定 ......
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