岩大戟内酯B诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡的实验研究(2)
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1.3.6 电镜观察 对数生长期状态良好的MCF-7细胞，种植3×106个细胞，铺五个直径100 mm的培养皿，用含5%胎牛血清的DMEM培养基，加入岩大戟内酯B浓度分别为0、10、20、40、80 μg/ml，2.5%的戊二醛固定24 h，1%四氧化铬固定24 h，置丙酮中逐级脱水，环氧树脂包埋，1 μm半薄切片，1% NaOH无水乙醇软化1 h，制备超薄切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，电子显微镜观察、拍片。
1.4 统计学处理 采用SPSS 11.5统计软件进行分析处理，计量资料以(x±s)表示，各组数据先行方差齐性检验， 再进行ANOVA单因素方差分析。均数间差别多重比较的LSD(Least significant difference)检验。
2 结果
2.1 岩大戟内酯B分子式(C28H26O4)和分子量(330.42)。
2.2 MTT法检测岩大戟内酯B对MCF-7乳腺癌细胞作用24、48、72 h；作用剂量为0、10、20、40、80 μg/ml；细胞生存数量显示呈时间和剂量依赖性，和A组相比差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。
*与A组比较，P<0.01
2.3 岩大戟内酯B对MCF-7细胞周期的影响 G0/G1期细胞无明显变化，G2/M期细胞减少，S期细胞增多，出现明显的Ap峰，与A组比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。
*与A组比较，P<0.01
2.4 岩大戟内酯B对MCF-7细胞凋亡率的影响 经岩大戟内酯B预处理24 h后，MCF-7细胞凋亡率增加，并有剂量依赖关系。见表3。
*与A组比较，P<0.01
2.5 电镜结果分析 对照组：瘤细胞呈条索状排列，核质比例大，巨核细胞多见， 核异形性强，核内常染色质多，核仁明显。胞质内线粒体显著增生、扩张，嵴模糊、脱颗粒，丰富的粗面内质网囊腔扩张，腔内充满低电子密度的蛋白粒子，核周高尔基复合体发达。药物处理组：异染色质相对增多，胞质内线粒体空泡变性，双层核膜结构清晰，细胞内膜结构完好，核固缩，染色质边集，细胞核形成核带和核突，有新月形或花环状(凋亡小体形成)，甚至出现坏死细胞形态。
3 讨论
狼毒大戟中岩大戟内酯B的含量较高，在0.040%～0.169%之间[6]。本研究中，笔者用MTT、流式细胞术和电镜技术观察了岩大戟内酯B对MCF-7肿瘤细胞生长的影响、细胞周期及细胞凋亡的影响。结果显示，岩大戟内酯B可抑制MCF-7肿瘤细胞的生长，并有时效和量效依赖性。肿瘤的发生、发展和癌变与细胞周期调节失控密切相关。细胞周期的顺利进行和完成依赖于一系列正负调节因子的相互作用，有细胞周期蛋白(cyclins)、细胞周期蛋白依赖性激酶 (cyclin-dependent kinases，CDKs)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白(cycin-dependent kinases inhibitor， CKI)肿瘤的形成是细胞增殖、凋亡和分化异常的结果。基于细胞分子生物学的现代医学研究表明，细胞周期与细胞癌变已不是两个独立的事件，肿瘤是一种细胞周期紊乱性疾病[7]。细胞周期蛋白分Cyclin A、B、C、D、E、F、G、H、I、K 十大类细胞周期蛋白多数通过在细胞周期时相性地合成与降解，调节对其依赖的蛋白激酶(CDK)活性，从而调控细胞周期进程。细胞周期是从一代向下一代传递的连续过程，因此是一个不断更新、不断从头开始的过程。整个周期表示为：G1期→S期→G2期→M期。岩大戟内酯B能减少G2/M期细胞，增加S期细胞，说明岩大戟内酯B阻滞肿瘤细胞在S 期细胞，影响其向G2/M期转化，并出现凋亡峰，凋亡率为31.26%。当前研究中发现的细胞周期S期阻滞，这与细胞周期调控复合体(CyclinA1/CDK2/PCNA Complex)的生成减少与p21CIP1表达上调密切相关。CyclinA1和CDK2属于正向细胞周期调控蛋白，PCNA是一种酸性核蛋白，与DNA合成关系密切，能促进DNA聚合酶延伸DNA的能力；而p21CIP1是细胞周期的负调控因子，高表达时可阻断正常细胞周期进程；在细胞周期中的DNA合成期的CyclinA1/CDK2/PCNA复合体含量，它是确保细胞从S期顺利进入G2/M的关键因素。Annexin V/PI染色表明，岩大戟内酯B使MCF-7细胞晚凋和死亡的细胞增多。电镜观察发现岩大戟内酯B明显促进MCF-7细胞凋亡，核固缩，空泡样变，细胞浆出芽，染色体边集。本研究显示，岩大戟内酯B具有明显的抑瘤作用。有效诱导MCF-7乳腺癌肿瘤细胞凋亡，可能是岩大戟内酯B抗肿瘤作用的机理之一。对于其他抗肿瘤途径，本实验室正在研究。
参考文献
[1]刘文粢，何风雷，阮子镛，等.狼毒大戟的化学成分研究[J].中国中药杂志，2001，26(3):180-182.
[2]刘文粢，何风雷，阮子镛，等.狼毒大戟二萜内酯对人癌细胞体外抑制作用的研究[J].中药材，2000，23(10):623-625.
[3]Liping Wang，Huiying Duan，Yishan Wang，et al.Inhibitory effects of Lang-duextract on the in vitro and in vivo growth of melanoma cells and its molecular mechanisms of action[J] ......
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