外源性p21waf1基因转染对人胃癌细胞系BGC-823增殖的影响(1)
 |
| 第1页 |
参见附件。
【摘要】 目的：探讨外源性p21waf1基因转染对人胃癌细胞系BGC-823细胞增殖的影响。方法：用脂质体介导的方法将pIRES-p21waf1真核表达载体转染人胃癌细胞系BGC-823，分为pIRES-p21waf1转染组、pIRES-neo空载体组及未转染组三个组别。应用实时荧光定量RT-PCR、Western blot免疫印迹分别在基因和蛋白两个水平检测各组p21的表达情况，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖能力，流式细胞仪分析细胞DNA周期变化，所有数据进行统计学分析。结果：p21waf1转染组p21waf1 mRNA和p21蛋白高表达(P<0.01)；p21waf1转染组BGC-823细胞生长速度明显低于空载体组和未转染组(P<0.01)；流式细胞仪观察到p21waf1转染组细胞的G1期细胞比例显著高于空载体组和未转染组(P<0.01)，S期比例显著低于空载体组和未转染组(P<0.01)，并出现凋亡峰。结论：p21waf1基因转染可以抑制人胃癌细胞系BGC-823细胞增殖并能诱导其发生细胞凋亡，可能为胃癌的基因治疗提供一条新的途径。
【关键词】 基因转染； p21waf1； 细胞增殖； 胃癌
p21waf1为野生型p53激活片段(wild-type p53 activated fragment 1，WAF1)，它为单拷贝基因，是一种非常重要的抑癌基因，也是目前研究热点[1]。它作为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CKI)家族成员，是细胞周期蛋白(cyclin)与细胞周期蛋白依赖激酶(CDKs)的广泛抑制剂，主要参与细胞周期调控[2]。已有研究证实，p21waf1基因突变或缺失与胃癌、食管癌、膀胱癌、乳腺癌、胆管癌等恶性肿瘤的发生发展及预后密切相关，以及通过改变p21waf1基因的表达可以起到调节肿瘤生长的作用[3-5]。因此，本研究将外源性p21waf1基因转染到人胃癌细胞系BGC-823中，使其稳定表达后，来研究其对人胃癌细胞增殖的影响。
1 材料与方法
1.1 实验材料 pIRES-p21waf1真核表达载体、人胃癌细胞系BGC-823(由青岛大学医学院附属医院中心实验室构建并惠赠)，基因转染试剂盒(QIAGEN公司)，Trizol试剂、DMEM-高糖培养基(Invitrogen公司)，RT-PCR试剂盒(Takara公司)，p21waf1及3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物及各自Taqman探针(由青岛大学医学院附属医院中心实验室提供)，鼠抗人p21waf1单克隆抗体(Santa Cruz公司)，兔抗鼠二抗、四甲基偶氮唑蓝(MTT)(QIAGEN公司)。
1.2 细胞培养方法 人胃癌细胞系BGC-823培养条件为含10%胎牛血清的DMEM-高糖完全培养液，37 ℃、5%CO2饱和湿度孵箱中孵育。倒置相差显微镜观察细胞形态，取对数生长期细胞进行相关实验。
1.3 基因转染条件和方法 参照QIAGEN转染试剂盒说明书进行。采用24孔板转染细胞，分三个组，分别为pIRES-p21waf1转染组、pIRES-neo空载体组、未转染组。
1.4 p21waf1 mRNA表达的检测 依次收集转染后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d的各组细胞，按照Trizol试剂盒说明提取总RNA。p21waf1基因引物设计：上游：5’-GGACAGCAGAGCACC
1.5 p21waf1蛋白表达的检测 依次收集转染后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d的各组细胞，提取细胞总蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，进行一抗(鼠抗人p21单克隆抗体)、二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗)孵育和显色，曝光并照相。使用HPIAS-1000型全自动图像分析仪分析蛋白条带灰度值。
1.6 细胞增殖能力的检测 各组均取对数生长期的细胞，采用经典的MTT法检测后，绘制细胞生长曲线，分析各组细胞的增殖能力。
1.7 细胞周期分布的检测 依次收集转染后12 h、24 h、48 h、3 d、5 d的各组细胞，各约1×106个细胞，加入终浓度70%冷乙醇，4 ℃固定24 h，PBS洗涤离心三遍，加入Rnase酶(2 mg/ml)于37 ℃水浴30 min，再加碘化丙啶(25 mg/ml)染色，4 ℃避光20 min，经尼龙网滤过后，上流式细胞仪检测各组细胞周期分布情况。
1.8 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件包进行处理，计量资料以(x±s)表示，两组间比较采用t 检验，计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.3 p21waf1基因转染对胃癌细胞BGC-823细胞增殖的影响 MTT证明，p21 waf1转染组胃癌细胞系BGC-823的增殖速度明显要低于空载体组、未转染组，p21waf1转染组在生长5 d后出现增殖速度减慢，而空载体组及未转染组则表现出持续增殖的态势，差异有统计学意义(P<0.01)。而空载体组及未转染组两组比较，差异无统计学意义(P>0 ......
您现在查看是摘要介绍页，详见PDF附件(2826kb)。