赤芍颗粒剂对泛耐药鲍曼不动杆菌的抗菌活性研究(2)
1.1.2 仪器与试剂 法国梅里埃公司VITEK2全自动细菌鉴定仪、恒温细菌培养箱、CO2恒温培养箱。血培养平板、巧克力培养平板、水解络蛋白培养基(MH培养基)均由广州迪景微生物公司生产，ATB细菌鉴定及药敏卡均由法国梅里埃公司生产，无菌生理盐水。
1.2 方法
1.2.1 鲍曼不动杆菌液配制 将保存在-70 ℃冰箱内临床常规标本分离中收集的50株泛耐药鲍曼不动杆菌取出室温(冰箱温度控制，要求每天观察1次温度变化，以保证温度在要求范围之内)，用无菌小镊子夹起菌种保存珠将细菌转种到血液营养培养基上，进行分区划线转种，然后放置在37 ℃培养18 h后，取出培养基，观察细菌生长情况，以第四区分离出单个菌落为转中成功，然后用无菌棉签挑起单个菌落，放在3 mL用无菌生理盐水中，用专用麦氏比浊仪，以生理盐水调零，将其调成0.5麦氏单位浊度的菌液备用，该菌浓度相当于1.5×109/L[7]。
1.2.2 赤芍颗粒剂溶液稀释 试验时赤芍颗粒剂的终浓度为：1024 μg/mL、512 μg/mL、256 μg/mL、128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL；用分析天平准确称取赤芍颗粒剂适量(相当于中药饮片约10.24 g)，将其溶解在100 mL的肉汤中，置于高压蒸汽中灭菌，完成后冷却，使其成为0.1024 g/mL的赤芍颗粒原液，在使其稀释成为10.24 mg/mL的应用液，在将其依次稀释为终浓度的10倍[8]。
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1.2.3 药敏试验 将上述配制好的各浓度赤芍颗粒溶液分别用无菌加样枪准确加入10 μL到相应的无菌96孔微量板的相应孔中，共有50组不同浓度稀释后的药物，然后将50株配制好的菌液各取90 μL，接种到96孔微量板的相应孔中，其中各组的第一列加入营养肉汤，不加药物，作为各组的阳性对照，和最后一列不加菌液作为空白对照。每孔总量为100 μL。加样完毕后，将其放入35 ℃恒温低速震荡培养箱(50 r/min)培养18 h[9]。
1.2.4 测定方法 将放置37 ℃恒温培养箱培养18 h后的微量板取出，在生物安全柜的日光灯下肉眼观察各组微量孔细菌的生长情况，以每微量板的每孔用细菌浑浊生长判断为有菌生长，以没空液体澄清则判断为无菌生长，再与阳性对照孔和空白孔比较，判断微量各组药物对该菌的体外抑菌情况，然后以各组无菌生长的最低药物浓度定位该组细菌的最低抑菌浓度(MIC)；然后再用无菌加样枪吸取10 μL无明显细菌生长的培养液接种在血平板培养基上，放入37 ℃细菌恒温培养箱中培养18 h，观察各组培养液在血平板上细菌生长情况，以无菌生长的最低药物浓度作为该菌株的最低杀菌浓度(MBC)。再将微量板用酶标仪检测每孔的吸光度值(OD值)，波长为450 nm[10]。
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1.3 统计学处理 使用SPSS 16.0统计软件对试验结果进行方差分析，计量资料以(x±s)表示，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
18 h培养后，观察各组阳性对照孔全部有细菌生长，各组空白对照孔菌无细菌生长，表明该组试验符合要求，试验结果可靠。
不同浓度的赤芍颗粒溶液对泛耐药鲍曼不动杆菌的OD值均小于阳性对照孔的OD值，并且随着药物浓度的增加，OD值也越来越小。OD值和赤芍颗粒溶液抑菌作用成反比，表明赤芍颗粒溶液均有抑制作用，并且随着药物浓度的增加，其抑菌作用越强。对不同浓度的赤芍颗粒溶液的抑菌作用的OD值进行单因素方差分析，差异有统计学意义(F=289.154，P<0.05)。与空白对照孔比较，试验菌株对赤芍颗粒溶液的最低抑菌浓度为64～128 μg/mL，标准菌株的最低抑菌浓度为128 μg/mL，表明赤芍颗粒对泛耐药鲍曼不动菌的生长能起到耐药的作用，见表1。
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3 讨论
随着临床上耐药菌株出现的越来越广泛，陈咏君等[11]对91例鲍曼不动杆菌的临床分布特点的研究表明，该菌主要发生在抵抗力较低的人群，如ICU病房的患者、较长时间卧床患者、癌症患者、糖尿病患者等，这部分人群在感染前均有长期在医院治疗的经历，而且大部分是呼吸道感染为主，并且导致能够有效治疗感染性疾病的抗生素渐渐减少，引起了医学界的广泛关注，因此，规范用药和研究新的治疗方法成了当务之急。虽然传统中药材的抗菌机制目前尚没有系统的理论依据，的文献报道中的多种试验已经证明，多种中药材在体外抑菌试验中能够有明显的抑菌作用，如左国营等[12]研究47种中草药提取物体外抗菌活性的筛选试验证明得到证明。而泛耐药鲍曼不动杆菌是临床上仅次于铜绿假单胞菌的条件致病菌，当机体抵抗力弱时，极易引起感染性疾病，且具有多种耐药基因，临床上常用的治疗方法为头孢哌酮舒巴坦联合米诺环素治疗，但随着耐药基因逐渐产生，效果渐渐欠佳[13]。虽然抗生素是治疗感染性疾病的有效手段，但每种新的抗生素产生之后，很快地细菌将会产生相应的耐药基因，但新的抗生素研发有落后于耐药基因产生的迹象，而中药有报道对细菌有明显的抑制作用，并且中药具有其他抗生素不具有的功效(如清热解毒、祛邪、调节免疫力等)[14]。有研究证明，黄芩、五味子、黄莲粉针剂等中药对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌等有抑制作用[15]。为此，结合中药和抗生素的优点，联合使用治疗感染性疾病具有广阔前景。在此笔者选用赤芍颗粒剂能够抑制泛耐药鲍曼不动菌杆生长的结果表明，赤芍颗粒剂可以作为一种潜在的新药物或药物增效剂用于泛耐药鲍曼不动杆菌的感染。
参考文献
[1]金茜，杨青，胡海棠，等.美罗培南联合舒巴坦对鲍曼不动杆菌体外抗菌活性的研究[J].中华检验医学杂志，2011，34(11)：979-983.
[2]胡云建.2006-2007年度报告：非发酵革兰阴性杆菌耐药监测[J].中国抗生素杂志，2008，33(10)：297-301., http://www.100md.com(王康椿 谭俊青 李蔼文)
1.2 方法
1.2.1 鲍曼不动杆菌液配制 将保存在-70 ℃冰箱内临床常规标本分离中收集的50株泛耐药鲍曼不动杆菌取出室温(冰箱温度控制，要求每天观察1次温度变化，以保证温度在要求范围之内)，用无菌小镊子夹起菌种保存珠将细菌转种到血液营养培养基上，进行分区划线转种，然后放置在37 ℃培养18 h后，取出培养基，观察细菌生长情况，以第四区分离出单个菌落为转中成功，然后用无菌棉签挑起单个菌落，放在3 mL用无菌生理盐水中，用专用麦氏比浊仪，以生理盐水调零，将其调成0.5麦氏单位浊度的菌液备用，该菌浓度相当于1.5×109/L[7]。
1.2.2 赤芍颗粒剂溶液稀释 试验时赤芍颗粒剂的终浓度为：1024 μg/mL、512 μg/mL、256 μg/mL、128 μg/mL、64 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL；用分析天平准确称取赤芍颗粒剂适量(相当于中药饮片约10.24 g)，将其溶解在100 mL的肉汤中，置于高压蒸汽中灭菌，完成后冷却，使其成为0.1024 g/mL的赤芍颗粒原液，在使其稀释成为10.24 mg/mL的应用液，在将其依次稀释为终浓度的10倍[8]。
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1.2.3 药敏试验 将上述配制好的各浓度赤芍颗粒溶液分别用无菌加样枪准确加入10 μL到相应的无菌96孔微量板的相应孔中，共有50组不同浓度稀释后的药物，然后将50株配制好的菌液各取90 μL，接种到96孔微量板的相应孔中，其中各组的第一列加入营养肉汤，不加药物，作为各组的阳性对照，和最后一列不加菌液作为空白对照。每孔总量为100 μL。加样完毕后，将其放入35 ℃恒温低速震荡培养箱(50 r/min)培养18 h[9]。
1.2.4 测定方法 将放置37 ℃恒温培养箱培养18 h后的微量板取出，在生物安全柜的日光灯下肉眼观察各组微量孔细菌的生长情况，以每微量板的每孔用细菌浑浊生长判断为有菌生长，以没空液体澄清则判断为无菌生长，再与阳性对照孔和空白孔比较，判断微量各组药物对该菌的体外抑菌情况，然后以各组无菌生长的最低药物浓度定位该组细菌的最低抑菌浓度(MIC)；然后再用无菌加样枪吸取10 μL无明显细菌生长的培养液接种在血平板培养基上，放入37 ℃细菌恒温培养箱中培养18 h，观察各组培养液在血平板上细菌生长情况，以无菌生长的最低药物浓度作为该菌株的最低杀菌浓度(MBC)。再将微量板用酶标仪检测每孔的吸光度值(OD值)，波长为450 nm[10]。
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1.3 统计学处理 使用SPSS 16.0统计软件对试验结果进行方差分析，计量资料以(x±s)表示，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
18 h培养后，观察各组阳性对照孔全部有细菌生长，各组空白对照孔菌无细菌生长，表明该组试验符合要求，试验结果可靠。
不同浓度的赤芍颗粒溶液对泛耐药鲍曼不动杆菌的OD值均小于阳性对照孔的OD值，并且随着药物浓度的增加，OD值也越来越小。OD值和赤芍颗粒溶液抑菌作用成反比，表明赤芍颗粒溶液均有抑制作用，并且随着药物浓度的增加，其抑菌作用越强。对不同浓度的赤芍颗粒溶液的抑菌作用的OD值进行单因素方差分析，差异有统计学意义(F=289.154，P<0.05)。与空白对照孔比较，试验菌株对赤芍颗粒溶液的最低抑菌浓度为64～128 μg/mL，标准菌株的最低抑菌浓度为128 μg/mL，表明赤芍颗粒对泛耐药鲍曼不动菌的生长能起到耐药的作用，见表1。
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3 讨论
随着临床上耐药菌株出现的越来越广泛，陈咏君等[11]对91例鲍曼不动杆菌的临床分布特点的研究表明，该菌主要发生在抵抗力较低的人群，如ICU病房的患者、较长时间卧床患者、癌症患者、糖尿病患者等，这部分人群在感染前均有长期在医院治疗的经历，而且大部分是呼吸道感染为主，并且导致能够有效治疗感染性疾病的抗生素渐渐减少，引起了医学界的广泛关注，因此，规范用药和研究新的治疗方法成了当务之急。虽然传统中药材的抗菌机制目前尚没有系统的理论依据，的文献报道中的多种试验已经证明，多种中药材在体外抑菌试验中能够有明显的抑菌作用，如左国营等[12]研究47种中草药提取物体外抗菌活性的筛选试验证明得到证明。而泛耐药鲍曼不动杆菌是临床上仅次于铜绿假单胞菌的条件致病菌，当机体抵抗力弱时，极易引起感染性疾病，且具有多种耐药基因，临床上常用的治疗方法为头孢哌酮舒巴坦联合米诺环素治疗，但随着耐药基因逐渐产生，效果渐渐欠佳[13]。虽然抗生素是治疗感染性疾病的有效手段，但每种新的抗生素产生之后，很快地细菌将会产生相应的耐药基因，但新的抗生素研发有落后于耐药基因产生的迹象，而中药有报道对细菌有明显的抑制作用，并且中药具有其他抗生素不具有的功效(如清热解毒、祛邪、调节免疫力等)[14]。有研究证明，黄芩、五味子、黄莲粉针剂等中药对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌等有抑制作用[15]。为此，结合中药和抗生素的优点，联合使用治疗感染性疾病具有广阔前景。在此笔者选用赤芍颗粒剂能够抑制泛耐药鲍曼不动菌杆生长的结果表明，赤芍颗粒剂可以作为一种潜在的新药物或药物增效剂用于泛耐药鲍曼不动杆菌的感染。
参考文献
[1]金茜，杨青，胡海棠，等.美罗培南联合舒巴坦对鲍曼不动杆菌体外抗菌活性的研究[J].中华检验医学杂志，2011，34(11)：979-983.
[2]胡云建.2006-2007年度报告：非发酵革兰阴性杆菌耐药监测[J].中国抗生素杂志，2008，33(10)：297-301., http://www.100md.com(王康椿 谭俊青 李蔼文)