HBV感染者DNA模板库的制备(1)
【摘要】 目的：提取乙型肝炎病毒感染人群基因组DNA，并制备成DNA模板供予HBV感染相关的基因多态性研究之用。方法：收集HBV感染人群抗凝全血，采用盐析法提取基因组DNA。结果：收集的HBV感染人群包括无症状携带者、慢性肝炎、重型肝炎、肝硬化以及肝癌，同时收集了一部分健康献血员病例。结论：模板库中主要为HBV持续感染病例，采用盐析法提取的DNA纯度高且稳定。
【关键词】 乙型肝炎病毒感染； 模板库； 基因多态性
【Abstract】 Objective：To extract human genomic DNA with HBV infection，and preparation of DNA template for studying the genetic polymorphism of HBV infection.Method：HBV infection of human anticoagulant whole blood were collected，Human genomic DNA was extracted by Miller’s Method.Result：DNA template in HBV infected person included asymptomatic carrier，chronic hepatitis，severe hepatitis，liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma，and part of a healthy blood donors were collected at the same time.Conclusion： The template library is mainly HBV persistent infection，extracted DNA with Miller’s Method has high purity and stability.
【Key words】 Hepatitis B virus infection； Template library； Gene polymorphism
First-author’s address：The First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.28.031
乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个严重的公共卫生问题，我国1992年的血清流行病学调查结果提示：国内一般人群的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阳性率为9.75%[1]，属于HBV感染的高流行区。HBV感染后容易慢性化，与肝硬化和肝癌的发生显著相关，部分还可转变为重型肝炎[2]。目前在HBV感染的遗传易感性研究中，疾病关联研究最常用。笔者进行HBV感染候选基因的关联研究所需的大样本量较欧、美等发达地区更具优势。关键之处则在于将收集的大量样本抽提出DNA并制备成分型所用96孔模板，这无疑是进行疾病关联研究的基础和前提。
1 资料与方法
1.1 一般资料 研究对象选择本院传染科门诊及病房2012年2月-2014年12月就治的太原地区汉族居民，静脉抽取10 mL EDTA-K2抗凝晨血：5 mL用于基因组DNA提取；5 mL用于病毒标志和生化检测；同时填写详细的临床资料并输入计算机。样本收集过程按照国家人类基因组研究伦理学准则进行，获得了收集对象的知情同意。乙型肝炎依据2000年西安第十次全国病毒性肝炎会议修订“病毒性肝炎防治方案”制定标准诊断[3]，另外笔者收集了部分血站献血员作为正常对照。
1.2 方法
1.2.1 人白细胞基因组DNA提取 采用Miller盐析法[4]进行。(1)EDTA-K2抗凝全血5 mL，置于50 mL有盖圆底离心管内。(2)加6～8倍体积(约35～40 mL)蒸馏水，反复颠倒混匀，于4 ℃ 5000 g离心20 min。(3)倾倒上清后于沉淀中加入预冷的0.1%Triton-X100(约35～40 mL)，轻柔混匀沉淀，再次于4 ℃ 5000 g离心20 min，然后弃上清。(4)加入2 mL裂解液于沉淀中，彻底打碎沉淀，然后加入10%SDS 100 μL至终浓度为0.5%，混匀。(5)加入10 mg/mL蛋白酶K 50 μL至终浓度为200 μg/mL，混匀，于55 ℃4 h或37 ℃过夜消化。(6)加入6.0M NaCl液0.7 mL，剧烈振荡20 s。(7)7000 g离心20 min，将上清移至50 mL有盖圆底离心管内。(8)加入2倍体积-20 ℃无水乙醇或95%乙醇，反复颠倒混匀，直至出现絮状沉淀，挑出DNA至一eppendorf管中。(9)1 mL 75%乙醇洗涤DNA两遍。自然晾干，用200 μL TE溶解DNA(4 ℃需要3～7 d)。(10)75%乙醇中的DNA离心，弃上清。(11)凝胶电泳确定所提DNA，UV计测定纯度和浓度，于TE中-20 ℃冻存。
1.2.2 模板的制备 (1)将所抽提的DNA样本定量后加水稀释至终浓度5～10 ng/μL置于96孔PCR板中。(2)每个96孔PCR板的最后2孔设为空白对照不加DNA样本。(3)用铝箔胶带封口。(4)于Eppendorf Centrifuge 5810R冷冻离心机中离心5 min。(5)置-20 ℃冰箱冻存备用。
2 结果
历时将近两年，去除因各种原因资料不全以及极少数抽提DNA不理想的样本，共收集到2561份DNA标本，全部制备成96孔模板。其中，男1940例，女621例，年龄21～75岁。
收集的病例包括急性乙型病毒性肝炎(AHB)15例，乙肝病毒携带者(AsC)279例，慢性乙型病毒性肝炎(CHB)1497例，肝癌(HCC)23例，肝硬化(LC)218例，重型乙型病毒性肝炎(SHB)168例，自身免疫性肝炎(AIH)15例，慢性丙型病毒性肝炎(CHC)16例，原发性胆汁性肝硬化(PBC)5例，其他原因所致疾病(Others)104例，同时收集正常献血员(BD)221例，详细患者临床资料见表1。(邓春青 冯珊珊)