HBV感染者DNA模板库的制备(1)
【摘要】 目的:提取乙型肝炎病毒感染人群基因组DNA,并制备成DNA模板供予HBV感染相关的基因多态性研究之用。方法:收集HBV感染人群抗凝全血,采用盐析法提取基因组DNA。结果:收集的HBV感染人群包括无症状携带者、慢性肝炎、重型肝炎、肝硬化以及肝癌,同时收集了一部分健康献血员病例。结论:模板库中主要为HBV持续感染病例,采用盐析法提取的DNA纯度高且稳定。
【关键词】 乙型肝炎病毒感染; 模板库; 基因多态性
【Abstract】 Objective:To extract human genomic DNA with HBV infection,and preparation of DNA template for studying the genetic polymorphism of HBV infection.Method:HBV infection of human anticoagulant whole blood were collected,Human genomic DNA was extracted by Miller’s Method.Result:DNA template in HBV infected person included asymptomatic carrier,chronic hepatitis,severe hepatitis,liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma,and part of a healthy blood donors were collected at the same time.Conclusion: The template library is mainly HBV persistent infection,extracted DNA with Miller’s Method has high purity and stability.
, 百拇医药
【Key words】 Hepatitis B virus infection; Template library; Gene polymorphism
First-author’s address:The First Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China
doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2015.28.031
乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个严重的公共卫生问题,我国1992年的血清流行病学调查结果提示:国内一般人群的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阳性率为9.75%[1],属于HBV感染的高流行区。HBV感染后容易慢性化,与肝硬化和肝癌的发生显著相关,部分还可转变为重型肝炎[2]。目前在HBV感染的遗传易感性研究中,疾病关联研究最常用。笔者进行HBV感染候选基因的关联研究所需的大样本量较欧、美等发达地区更具优势。关键之处则在于将收集的大量样本抽提出DNA并制备成分型所用96孔模板,这无疑是进行疾病关联研究的基础和前提。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 一般资料 研究对象选择本院传染科门诊及病房2012年2月-2014年12月就治的太原地区汉族居民,静脉抽取10 mL EDTA-K2抗凝晨血:5 mL用于基因组DNA提取;5 mL用于病毒标志和生化检测;同时填写详细的临床资料并输入计算机。样本收集过程按照国家人类基因组研究伦理学准则进行,获得了收集对象的知情同意。乙型肝炎依据2000年西安第十次全国病毒性肝炎会议修订“病毒性肝炎防治方案”制定标准诊断[3],另外笔者收集了部分血站献血员作为正常对照。
1.2 方法
1.2.1 人白细胞基因组DNA提取 采用Miller盐析法[4]进行。(1)EDTA-K2抗凝全血5 mL,置于50 mL有盖圆底离心管内。(2)加6~8倍体积(约35~40 mL)蒸馏水,反复颠倒混匀,于4 ℃ 5000 g离心20 min。(3)倾倒上清后于沉淀中加入预冷的0.1%Triton-X100(约35~40 mL),轻柔混匀沉淀,再次于4 ℃ 5000 g离心20 min,然后弃上清。(4)加入2 mL裂解液于沉淀中,彻底打碎沉淀,然后加入10%SDS 100 μL至终浓度为0.5%,混匀。(5)加入10 mg/mL蛋白酶K 50 μL至终浓度为200 μg/mL,混匀,于55 ℃4 h或37 ℃过夜消化。(6)加入6.0M NaCl液0.7 mL,剧烈振荡20 s。(7)7000 g离心20 min,将上清移至50 mL有盖圆底离心管内。(8)加入2倍体积-20 ℃无水乙醇或95%乙醇,反复颠倒混匀,直至出现絮状沉淀,挑出DNA至一eppendorf管中。(9)1 mL 75%乙醇洗涤DNA两遍。自然晾干,用200 μL TE溶解DNA(4 ℃需要3~7 d)。(10)75%乙醇中的DNA离心,弃上清。(11)凝胶电泳确定所提DNA,UV计测定纯度和浓度,于TE中-20 ℃冻存。
, 百拇医药
1.2.2 模板的制备 (1)将所抽提的DNA样本定量后加水稀释至终浓度5~10 ng/μL置于96孔PCR板中。(2)每个96孔PCR板的最后2孔设为空白对照不加DNA样本。(3)用铝箔胶带封口。(4)于Eppendorf Centrifuge 5810R冷冻离心机中离心5 min。(5)置-20 ℃冰箱冻存备用。
2 结果
历时将近两年,去除因各种原因资料不全以及极少数抽提DNA不理想的样本,共收集到2561份DNA标本,全部制备成96孔模板。其中,男1940例,女621例,年龄21~75岁。
收集的病例包括急性乙型病毒性肝炎(AHB)15例,乙肝病毒携带者(AsC)279例,慢性乙型病毒性肝炎(CHB)1497例,肝癌(HCC)23例,肝硬化(LC)218例,重型乙型病毒性肝炎(SHB)168例,自身免疫性肝炎(AIH)15例,慢性丙型病毒性肝炎(CHC)16例,原发性胆汁性肝硬化(PBC)5例,其他原因所致疾病(Others)104例,同时收集正常献血员(BD)221例,详细患者临床资料见表1。, 百拇医药(邓春青 冯珊珊)
【关键词】 乙型肝炎病毒感染; 模板库; 基因多态性
【Abstract】 Objective:To extract human genomic DNA with HBV infection,and preparation of DNA template for studying the genetic polymorphism of HBV infection.Method:HBV infection of human anticoagulant whole blood were collected,Human genomic DNA was extracted by Miller’s Method.Result:DNA template in HBV infected person included asymptomatic carrier,chronic hepatitis,severe hepatitis,liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma,and part of a healthy blood donors were collected at the same time.Conclusion: The template library is mainly HBV persistent infection,extracted DNA with Miller’s Method has high purity and stability.
, 百拇医药
【Key words】 Hepatitis B virus infection; Template library; Gene polymorphism
First-author’s address:The First Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China
doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2015.28.031
乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个严重的公共卫生问题,我国1992年的血清流行病学调查结果提示:国内一般人群的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阳性率为9.75%[1],属于HBV感染的高流行区。HBV感染后容易慢性化,与肝硬化和肝癌的发生显著相关,部分还可转变为重型肝炎[2]。目前在HBV感染的遗传易感性研究中,疾病关联研究最常用。笔者进行HBV感染候选基因的关联研究所需的大样本量较欧、美等发达地区更具优势。关键之处则在于将收集的大量样本抽提出DNA并制备成分型所用96孔模板,这无疑是进行疾病关联研究的基础和前提。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 一般资料 研究对象选择本院传染科门诊及病房2012年2月-2014年12月就治的太原地区汉族居民,静脉抽取10 mL EDTA-K2抗凝晨血:5 mL用于基因组DNA提取;5 mL用于病毒标志和生化检测;同时填写详细的临床资料并输入计算机。样本收集过程按照国家人类基因组研究伦理学准则进行,获得了收集对象的知情同意。乙型肝炎依据2000年西安第十次全国病毒性肝炎会议修订“病毒性肝炎防治方案”制定标准诊断[3],另外笔者收集了部分血站献血员作为正常对照。
1.2 方法
1.2.1 人白细胞基因组DNA提取 采用Miller盐析法[4]进行。(1)EDTA-K2抗凝全血5 mL,置于50 mL有盖圆底离心管内。(2)加6~8倍体积(约35~40 mL)蒸馏水,反复颠倒混匀,于4 ℃ 5000 g离心20 min。(3)倾倒上清后于沉淀中加入预冷的0.1%Triton-X100(约35~40 mL),轻柔混匀沉淀,再次于4 ℃ 5000 g离心20 min,然后弃上清。(4)加入2 mL裂解液于沉淀中,彻底打碎沉淀,然后加入10%SDS 100 μL至终浓度为0.5%,混匀。(5)加入10 mg/mL蛋白酶K 50 μL至终浓度为200 μg/mL,混匀,于55 ℃4 h或37 ℃过夜消化。(6)加入6.0M NaCl液0.7 mL,剧烈振荡20 s。(7)7000 g离心20 min,将上清移至50 mL有盖圆底离心管内。(8)加入2倍体积-20 ℃无水乙醇或95%乙醇,反复颠倒混匀,直至出现絮状沉淀,挑出DNA至一eppendorf管中。(9)1 mL 75%乙醇洗涤DNA两遍。自然晾干,用200 μL TE溶解DNA(4 ℃需要3~7 d)。(10)75%乙醇中的DNA离心,弃上清。(11)凝胶电泳确定所提DNA,UV计测定纯度和浓度,于TE中-20 ℃冻存。
, 百拇医药
1.2.2 模板的制备 (1)将所抽提的DNA样本定量后加水稀释至终浓度5~10 ng/μL置于96孔PCR板中。(2)每个96孔PCR板的最后2孔设为空白对照不加DNA样本。(3)用铝箔胶带封口。(4)于Eppendorf Centrifuge 5810R冷冻离心机中离心5 min。(5)置-20 ℃冰箱冻存备用。
2 结果
历时将近两年,去除因各种原因资料不全以及极少数抽提DNA不理想的样本,共收集到2561份DNA标本,全部制备成96孔模板。其中,男1940例,女621例,年龄21~75岁。
收集的病例包括急性乙型病毒性肝炎(AHB)15例,乙肝病毒携带者(AsC)279例,慢性乙型病毒性肝炎(CHB)1497例,肝癌(HCC)23例,肝硬化(LC)218例,重型乙型病毒性肝炎(SHB)168例,自身免疫性肝炎(AIH)15例,慢性丙型病毒性肝炎(CHC)16例,原发性胆汁性肝硬化(PBC)5例,其他原因所致疾病(Others)104例,同时收集正常献血员(BD)221例,详细患者临床资料见表1。, 百拇医药(邓春青 冯珊珊)