血管性痴呆与神经束蛋白155的相关性研究(2)
【Key words】 Chronic ischemia； Vascular dementi； Neurofascin155
First-author’s address：The First Hospital of Jilin University，Changchun 130031，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.30.005
血管性痴呆(Vascular dementia，VD)指的是出血性、缺血性以及急性和慢性缺血缺氧性脑血管疾病所导致的脑组织损伤进而诱发的认知功能障碍的一种临床综合征，其发病机制尚未完全清楚[1-2]。研究探讨其发病机制并在此基础上有针对性地进行适当干预对于预防血管性痴呆具有非常重要的意义。有研究显示白质脱髓鞘是VD的发病机制之一，而神经束蛋白155(Neurofascin155，NF155)在保持髓鞘的稳定中起到了关键的作用，NF155缺失会造成轴突-胶质间隔样连接消失，从而降低神经传导的速度[4-6]。本研究通过对慢性缺血致血管性痴呆大鼠脑内NF155的水平进行分析，旨在进一步明确慢性缺血是否通过影响NF155，进而破坏髓鞘的稳定性，从而出现血管性痴呆。
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1 材料与方法
1.1 实验动物 2013年12月-2014年5月期间选择清洁级雄性Wistar大鼠40只，大鼠的质量为250～300 g，由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供及喂养，实验动物生产许可证：SCXK(吉)2012-0005，实验动物使用许可证：SYXK (吉)2012-0012，实验在吉林大学基础实验室进行。
1.2 实验动物分组及模型制备 实验动物进行Morris水迷宫检测，检测期间统计40只大鼠在6 d里的训练成绩，其总平均潜伏期为(30.85±9.45)s，期间死亡1只，另有3只大鼠不符合标准。将大鼠随机分为假手术对照组12只，模型组24只(30 d组12只，60 d组12只)。大鼠称重，按10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，采用2VO法复制慢性前脑缺血致血管性痴呆的动物模型。假手术对照组除不结扎、不剪断颈总动脉，其余过程与模型组相同。造模后第5天开始水迷宫试验，5次/d，2 min次/，共5 d。测试第3天，开始记录成绩，如测试第5天，逃避潜伏期仍超过20 s或2次误入其他盲端即为血管性痴呆模型。术后30 d和60 d将模型组大鼠和相应对照组大鼠用10%水合氯醛麻醉。然后在冰盘上快速断头取脑，将出脑组织置于玻璃匀浆器中研磨，2000 r/min离心15 min，取上清，无菌过滤后-80 ℃保存备用。
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1.3 NF155的检测方法 标准品按以下浓度稀释：3 ng/mL、6 ng/mL、12 ng/mL、24 ng/mL、48 ng/mL。(NF155抗体，产地：中国上海，规格：1.0 g)，分别设定样品孔、标准品孔和空白孔。将稀释后的不同浓度标准品加入准品孔中，样本孔内先加入10 μL待测样本，然后用稀释液稀释5倍，空白孔不加。各样本孔和标准品中每孔均加入100 μL辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体，封板膜密封，37 ℃水浴60 min。弃去液体后拍干，加洗涤液300 μL/孔，静置1 min后拍干，如此重复5 次，然后拍干。分别加入底物A和底物B 50 μL/孔，37 ℃避光孵育15 min。取出酶标板，加终止液终止反应50 μL/孔。以空白孔调零，在450 nm波长下测量各孔的吸光度值(OD值)。终止后15 min内检测完成，以标准品的浓度和OD值作标准曲线，然后根据样品的OD值和标准曲线所对应的公式计算出NF155的浓度值即可。
1.4 统计学处理 使用SPSS 20.0统计软件进行分析，计量资料用(x±s)表示，比较采用t检验，各组间样本均数行方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
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2 结果
2.1 各组的Morris水迷宫结果比较 造模前水迷宫实验发现，模型组小鼠逃避潜伏期与假手术对照组之间的差异没有统计学意义(P>0.05)。造模后水迷宫实验发现，术后30 d组第6天开始，大鼠逃避潜伏期均明显长于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)；术后60 d组第5天开始，逃避潜伏期均明显长于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1～2。
2.2 各组的NF155检测结果比较 经检测，假手术对照组的NF155浓度为(85.07±6.75)ng/mL，术后30 d组的NF155浓度为(48.27±7.32)ng/mL，术后60 d组的NF155浓度为(37.65±6.88)ng/mL，比较分析发现，术后30 d组和术后60 d组的NF155浓度均明显低于假手术对照组，差异均有统计学意义(t=12.803、7.043，P=0.000、0.000)；而术后30 d组NF155浓度又明显高于术后60 d组，两组比较差异有统计学意义(t=3.662，P=0.001)。
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3 讨论
血管性痴呆的发病原因主要是由缺血性、缺氧性、出血性脑血管病等导致脑组织损害引起的，其主要临床特征是认知功能障碍，临床上患者通常表现为认知能力减退、学习能力和记忆功能衰退以及行为障碍等[7]。随着我国人口老龄化程度加深，脑血管病发病率以及血管性痴呆的发病率逐渐上升。临床流行病学研究资料显示，我国血管性痴呆的发病率明显高于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，不仅严重危害老年人生活质量，同时也给患者的家庭和社会带来沉重的负担[8]。国外研究显示VD是防治痴呆的主要突破口，因此探讨其发病机制同时寻求切实有效的治疗方法是解决这一问题的关键[9]。
前期病理研究表明，当慢性脑缺血大鼠额、颞叶皮质神经细胞以缺血性改变为主时，脑白质会出现神经纤维断裂及髓鞘脱失的改变，证明全脑缺血的大鼠脑白质损伤也是重要的病理改变之一[10-12]。因此本课题专注于研究慢性脑缺血所致血管性痴呆大鼠白质相关的改变。, http://www.100md.com(赵腾 陈海龙 刘晶瑶 孙莉 周春奎)
First-author’s address：The First Hospital of Jilin University，Changchun 130031，China
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血管性痴呆(Vascular dementia，VD)指的是出血性、缺血性以及急性和慢性缺血缺氧性脑血管疾病所导致的脑组织损伤进而诱发的认知功能障碍的一种临床综合征，其发病机制尚未完全清楚[1-2]。研究探讨其发病机制并在此基础上有针对性地进行适当干预对于预防血管性痴呆具有非常重要的意义。有研究显示白质脱髓鞘是VD的发病机制之一，而神经束蛋白155(Neurofascin155，NF155)在保持髓鞘的稳定中起到了关键的作用，NF155缺失会造成轴突-胶质间隔样连接消失，从而降低神经传导的速度[4-6]。本研究通过对慢性缺血致血管性痴呆大鼠脑内NF155的水平进行分析，旨在进一步明确慢性缺血是否通过影响NF155，进而破坏髓鞘的稳定性，从而出现血管性痴呆。
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1 材料与方法
1.1 实验动物 2013年12月-2014年5月期间选择清洁级雄性Wistar大鼠40只，大鼠的质量为250～300 g，由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供及喂养，实验动物生产许可证：SCXK(吉)2012-0005，实验动物使用许可证：SYXK (吉)2012-0012，实验在吉林大学基础实验室进行。
1.2 实验动物分组及模型制备 实验动物进行Morris水迷宫检测，检测期间统计40只大鼠在6 d里的训练成绩，其总平均潜伏期为(30.85±9.45)s，期间死亡1只，另有3只大鼠不符合标准。将大鼠随机分为假手术对照组12只，模型组24只(30 d组12只，60 d组12只)。大鼠称重，按10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，采用2VO法复制慢性前脑缺血致血管性痴呆的动物模型。假手术对照组除不结扎、不剪断颈总动脉，其余过程与模型组相同。造模后第5天开始水迷宫试验，5次/d，2 min次/，共5 d。测试第3天，开始记录成绩，如测试第5天，逃避潜伏期仍超过20 s或2次误入其他盲端即为血管性痴呆模型。术后30 d和60 d将模型组大鼠和相应对照组大鼠用10%水合氯醛麻醉。然后在冰盘上快速断头取脑，将出脑组织置于玻璃匀浆器中研磨，2000 r/min离心15 min，取上清，无菌过滤后-80 ℃保存备用。
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1.3 NF155的检测方法 标准品按以下浓度稀释：3 ng/mL、6 ng/mL、12 ng/mL、24 ng/mL、48 ng/mL。(NF155抗体，产地：中国上海，规格：1.0 g)，分别设定样品孔、标准品孔和空白孔。将稀释后的不同浓度标准品加入准品孔中，样本孔内先加入10 μL待测样本，然后用稀释液稀释5倍，空白孔不加。各样本孔和标准品中每孔均加入100 μL辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体，封板膜密封，37 ℃水浴60 min。弃去液体后拍干，加洗涤液300 μL/孔，静置1 min后拍干，如此重复5 次，然后拍干。分别加入底物A和底物B 50 μL/孔，37 ℃避光孵育15 min。取出酶标板，加终止液终止反应50 μL/孔。以空白孔调零，在450 nm波长下测量各孔的吸光度值(OD值)。终止后15 min内检测完成，以标准品的浓度和OD值作标准曲线，然后根据样品的OD值和标准曲线所对应的公式计算出NF155的浓度值即可。
1.4 统计学处理 使用SPSS 20.0统计软件进行分析，计量资料用(x±s)表示，比较采用t检验，各组间样本均数行方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
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2.1 各组的Morris水迷宫结果比较 造模前水迷宫实验发现，模型组小鼠逃避潜伏期与假手术对照组之间的差异没有统计学意义(P>0.05)。造模后水迷宫实验发现，术后30 d组第6天开始，大鼠逃避潜伏期均明显长于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)；术后60 d组第5天开始，逃避潜伏期均明显长于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1～2。
2.2 各组的NF155检测结果比较 经检测，假手术对照组的NF155浓度为(85.07±6.75)ng/mL，术后30 d组的NF155浓度为(48.27±7.32)ng/mL，术后60 d组的NF155浓度为(37.65±6.88)ng/mL，比较分析发现，术后30 d组和术后60 d组的NF155浓度均明显低于假手术对照组，差异均有统计学意义(t=12.803、7.043，P=0.000、0.000)；而术后30 d组NF155浓度又明显高于术后60 d组，两组比较差异有统计学意义(t=3.662，P=0.001)。
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3 讨论
血管性痴呆的发病原因主要是由缺血性、缺氧性、出血性脑血管病等导致脑组织损害引起的，其主要临床特征是认知功能障碍，临床上患者通常表现为认知能力减退、学习能力和记忆功能衰退以及行为障碍等[7]。随着我国人口老龄化程度加深，脑血管病发病率以及血管性痴呆的发病率逐渐上升。临床流行病学研究资料显示，我国血管性痴呆的发病率明显高于阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，不仅严重危害老年人生活质量，同时也给患者的家庭和社会带来沉重的负担[8]。国外研究显示VD是防治痴呆的主要突破口，因此探讨其发病机制同时寻求切实有效的治疗方法是解决这一问题的关键[9]。
前期病理研究表明，当慢性脑缺血大鼠额、颞叶皮质神经细胞以缺血性改变为主时，脑白质会出现神经纤维断裂及髓鞘脱失的改变，证明全脑缺血的大鼠脑白质损伤也是重要的病理改变之一[10-12]。因此本课题专注于研究慢性脑缺血所致血管性痴呆大鼠白质相关的改变。, http://www.100md.com(赵腾 陈海龙 刘晶瑶 孙莉 周春奎)