肿瘤细胞特异启动子hTERT介导的靶向mdr1基因的RNAi用于逆转卵巢癌细胞MDR的研究(2)
First-author’s address：Zhongshan Hospital Affiliated to Xiamen University，Xiamen 361005，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.34.003
卵巢癌死亡率居妇科恶性肿瘤之首，患者对化学治疗药物的耐药及多药耐药(MDR)是造成总体预后不良的主要原因之一，如何逆转MDR已成为目前肿瘤化疗研究的热点。研究显示，mdr1基因及其表达产物P-gp蛋白是引起肿瘤细胞产生MDR现象的主要原因[1-2]。故应用RNAi技术抑制肿瘤细胞中mdr1基因的表达，下调P-gp蛋白表达水平是逆转MDR的一种重要方法。目前已有研究显示，靶向mdr1基因的siRNA可用于下调卵巢癌细胞的P-gp蛋白表达水平[3]。而在RNAi技术应用中，除了需要获得具有高效抑制能力的RNAi元件，如何实现RNAi元件在特定组织细胞中的高效特异表达也是十分重要的。P-gp蛋白也存在于人正常组织中，故使RNAi元件的表达仅限于目标肿瘤细胞显得尤为重要。但目前siRNA表达中常规使用的启动子如H1、U6等均缺乏组织特异性，不能满足要求。人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)启动子是一种肿瘤细胞特异性启动子，在大多数正常组织中不具表达活性，已被报道可用于在肺癌、肝癌、卵巢癌等肿瘤细胞中特异表达外源基因[4]。目前，应用hTERT启动子介导RNAi元件用于卵巢癌细胞的MDR逆转研究尚未见报道。本研究即提出了以肿瘤组织特异性hTERT启动子介导靶向mdr1基因的siRNA在卵巢癌细胞中的特异表达，以达到特异性抑制mdr1表达并逆转卵巢癌MDR的目的。本研究结果可为进一步开展逆转卵巢癌MDR研究提供重要基础，现将本研究报道如下。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料 限制性核酸内切酶、磷酸化酶分别购自大连宝生物工程有限公司、New England Biolabs公司或华美生物工程公司，T4 DNA连接酶购自北京天根公司，Taq酶购自上海生工公司，质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒为上海华舜公司产品，DMEM培养基、Opti-MEM、Glutamine、细胞培养用非必需氨基酸购自Invitrogen公司，酵母粉购自OXOID公司，配液用水由Millipore公司纯水仪过滤，脂质体Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，细胞培养用胎牛血清(FBS)购自Gibico公司。Dual-Luciferase?双萤光素酶报告基因检测系统购自Promega公司，抗体Phycoerythrin(PE) Anti-Human MDR1购自BD Pharmingen?公司，SYBR PrimeScriptTM RT-PCR kit购自TaKaRa公司，Cell Counting Kit-8试剂购自碧云天公司。
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1.2 方法
1.2.1 phTERT-siMDR1B表达载体的构建 在前期研究中已筛选获得1个可高效靶向mdr1基因的siRNA元件siMDR1B[5]。其靶序列为：5’-AGAAAGAACTTGAAAGGTA-3’(位于mdr1基因序列的1230～1248 nt)。以靶向HBV基因的B245作为对照[6]。合成各siRNA靶点序列所对应的siRNA引物(表1)，引物两端分别引入Hind Ⅲ与Bgl Ⅱ酶切位点，经退火处理后与Bgl Ⅱ/Hind Ⅲ双酶切处理的pBT-del-279载体连接，经酶切及测序鉴定后获得携带hTERT启动子引导的siMDR1B表达元件的表达载体phTERT-siMDR1B及对照质粒phTERT-B245。
表1 siRNA合成的引物序列
名称引物序列
siMDR1Bf5’-GATCCCCAGAAAGAACTTGAAAGGTATTCAAGAGATACCTTTCAAGTTCTTTCTTTTTTA-3’
, http://www.100md.com
siMDR1Br5’-AGCTTAAAAAAGAAAGAACTTGAAAGGTATCTCTTGAATACCTTTCAAGTTCTTTCTGGG-3’
B245-f5’-GATCCCCAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTTCAAGAGAAGTCCACCACGAGTCTAGACTTTTTTA-3’
B245-r5’-AGCTTAAAAAAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTTGAAAGTCCACCACGAGTCTAGACTGGG-3’
1.2.2 报告质粒的构建 合成PCR引物(表2)扩增mdr1基因上不包含和包含siMDR1B靶点所在位置的约250 bp长度的DNA序列(MT1和MT2)，其中siMDR1B靶点序列位于MT2序列中。PCR产物分别与pMD18-T载体连接，经酶切及测序鉴定获得含单倍体靶序列的质粒pT-T。pT-T经BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ双酶切后回收目的片段，再与经Bgl Ⅱ/EcoR Ⅰ双酶切处理的pT-T载体连接获得含双倍体靶序列的pT-TT。pT-TT经BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ双酶切后回收双倍体靶序列片段，与经同样双酶切处理的pST-luc载体连接，经酶切鉴定得到分别含不同区段双倍体靶序列的报告质粒pSTluc-MT1和pSTluc-MT2。
表2 报告质粒PCR扩增引物序列
名称引物序列
MT1-f5’-CCGGAATTCCGG GACCGCAATGGAGGAGCAAAG-3’
MT1-r5’-CGCGGATCCGCG CTCCAGATTCATGAAGAACCC-3’
MT2-f5’-CCGGAATTCCGG AGCTGGAGCAGTAGCTGAAGA-3’, http://www.100md.com(林燕真 程通 张雅丽 李瑞银 杨连威 温兰玲)
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.34.003
卵巢癌死亡率居妇科恶性肿瘤之首，患者对化学治疗药物的耐药及多药耐药(MDR)是造成总体预后不良的主要原因之一，如何逆转MDR已成为目前肿瘤化疗研究的热点。研究显示，mdr1基因及其表达产物P-gp蛋白是引起肿瘤细胞产生MDR现象的主要原因[1-2]。故应用RNAi技术抑制肿瘤细胞中mdr1基因的表达，下调P-gp蛋白表达水平是逆转MDR的一种重要方法。目前已有研究显示，靶向mdr1基因的siRNA可用于下调卵巢癌细胞的P-gp蛋白表达水平[3]。而在RNAi技术应用中，除了需要获得具有高效抑制能力的RNAi元件，如何实现RNAi元件在特定组织细胞中的高效特异表达也是十分重要的。P-gp蛋白也存在于人正常组织中，故使RNAi元件的表达仅限于目标肿瘤细胞显得尤为重要。但目前siRNA表达中常规使用的启动子如H1、U6等均缺乏组织特异性，不能满足要求。人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)启动子是一种肿瘤细胞特异性启动子，在大多数正常组织中不具表达活性，已被报道可用于在肺癌、肝癌、卵巢癌等肿瘤细胞中特异表达外源基因[4]。目前，应用hTERT启动子介导RNAi元件用于卵巢癌细胞的MDR逆转研究尚未见报道。本研究即提出了以肿瘤组织特异性hTERT启动子介导靶向mdr1基因的siRNA在卵巢癌细胞中的特异表达，以达到特异性抑制mdr1表达并逆转卵巢癌MDR的目的。本研究结果可为进一步开展逆转卵巢癌MDR研究提供重要基础，现将本研究报道如下。
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1 材料与方法
1.1 材料 限制性核酸内切酶、磷酸化酶分别购自大连宝生物工程有限公司、New England Biolabs公司或华美生物工程公司，T4 DNA连接酶购自北京天根公司，Taq酶购自上海生工公司，质粒小量提取试剂盒、胶回收试剂盒为上海华舜公司产品，DMEM培养基、Opti-MEM、Glutamine、细胞培养用非必需氨基酸购自Invitrogen公司，酵母粉购自OXOID公司，配液用水由Millipore公司纯水仪过滤，脂质体Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，细胞培养用胎牛血清(FBS)购自Gibico公司。Dual-Luciferase?双萤光素酶报告基因检测系统购自Promega公司，抗体Phycoerythrin(PE) Anti-Human MDR1购自BD Pharmingen?公司，SYBR PrimeScriptTM RT-PCR kit购自TaKaRa公司，Cell Counting Kit-8试剂购自碧云天公司。
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1.2 方法
1.2.1 phTERT-siMDR1B表达载体的构建 在前期研究中已筛选获得1个可高效靶向mdr1基因的siRNA元件siMDR1B[5]。其靶序列为：5’-AGAAAGAACTTGAAAGGTA-3’(位于mdr1基因序列的1230～1248 nt)。以靶向HBV基因的B245作为对照[6]。合成各siRNA靶点序列所对应的siRNA引物(表1)，引物两端分别引入Hind Ⅲ与Bgl Ⅱ酶切位点，经退火处理后与Bgl Ⅱ/Hind Ⅲ双酶切处理的pBT-del-279载体连接，经酶切及测序鉴定后获得携带hTERT启动子引导的siMDR1B表达元件的表达载体phTERT-siMDR1B及对照质粒phTERT-B245。
表1 siRNA合成的引物序列
名称引物序列
siMDR1Bf5’-GATCCCCAGAAAGAACTTGAAAGGTATTCAAGAGATACCTTTCAAGTTCTTTCTTTTTTA-3’
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siMDR1Br5’-AGCTTAAAAAAGAAAGAACTTGAAAGGTATCTCTTGAATACCTTTCAAGTTCTTTCTGGG-3’
B245-f5’-GATCCCCAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTTCAAGAGAAGTCCACCACGAGTCTAGACTTTTTTA-3’
B245-r5’-AGCTTAAAAAAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTTGAAAGTCCACCACGAGTCTAGACTGGG-3’
1.2.2 报告质粒的构建 合成PCR引物(表2)扩增mdr1基因上不包含和包含siMDR1B靶点所在位置的约250 bp长度的DNA序列(MT1和MT2)，其中siMDR1B靶点序列位于MT2序列中。PCR产物分别与pMD18-T载体连接，经酶切及测序鉴定获得含单倍体靶序列的质粒pT-T。pT-T经BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ双酶切后回收目的片段，再与经Bgl Ⅱ/EcoR Ⅰ双酶切处理的pT-T载体连接获得含双倍体靶序列的pT-TT。pT-TT经BamH Ⅰ/EcoR Ⅰ双酶切后回收双倍体靶序列片段，与经同样双酶切处理的pST-luc载体连接，经酶切鉴定得到分别含不同区段双倍体靶序列的报告质粒pSTluc-MT1和pSTluc-MT2。
表2 报告质粒PCR扩增引物序列
名称引物序列
MT1-f5’-CCGGAATTCCGG GACCGCAATGGAGGAGCAAAG-3’
MT1-r5’-CGCGGATCCGCG CTCCAGATTCATGAAGAACCC-3’
MT2-f5’-CCGGAATTCCGG AGCTGGAGCAGTAGCTGAAGA-3’, http://www.100md.com(林燕真 程通 张雅丽 李瑞银 杨连威 温兰玲)