中华苦荬菜提取物Chinensiolide A的体外抗肿瘤活性(2)
1.2 仪器与设备 Safire2多功能酶标仪购自奥地利，洁净操作台购自苏净集团安泰公司，二氧化碳孵箱购自日本三洋公司，Olympus IX70-SIF2倒置显微镜；恒温水浴锅，电子天平购自德国赛多利斯集团，微量移液器购自Gilson公司。
1.3 实验方法
1.3.1 药液配制 精密称取Chinensiolide A 粉末适量，转至1 mL量瓶中，加入DMSO稀释至刻度，充分溶解，使母液浓度为55 mmol/L。取母液10 μL，加入不含血清的培养基990 μL，稀释至550 μmol/L的工作液。过滤除菌后使用，现用现配。取上述工作液10 μL，加至100 μL细胞液中，终浓度为50 μmol/L，确保DMSO的终浓度不超过0.1%。
1.3.2 细胞培养 将肺腺癌A549细胞、肝癌Ble-7402细胞及结直肠腺癌LoVo细胞分别置于5 mL DMEM培养液的培养瓶中，在37 ℃、体积分数为5%的CO2的培养箱中培养，细胞呈贴壁生长，复苏次日及隔日更换培养液，待细胞至对数生长期进行传代，消化液为0.25%胰蛋白酶与0.02% EDTA[7]。实验选择处于对数生长期的细胞进行研究。
, http://www.100md.com
1.3.3 MTT法测细胞活性 对数生长期的A549细胞、Ble-7402细胞及LoVo细胞，消化后计数制成细胞悬液，浓度为4×104个/mL，取100 μL接种于96孔板中，培养24 h后，加入不同浓度的Chinensiolide A，加样体积为10 μL/孔，对照孔加DMSO，继续培养24 h，然后每孔加入6 mg/mL的MTT磷酸缓冲液10 μL，同条件下继续培养4 h，弃孔内原有液体，加DMSO 150 μL/孔，振荡以充分溶解结晶，用全自动酶标仪测定570 nm处的吸光度(D值)(参比波长630 nm)。以溶剂对照组细胞存活率为100%，计算不同浓度的Chinensiolide A实验组细胞的存活率和抑制率。计算公式如下：存活率=(Chinensiolide A 实验组D值/对照组D值)×100%；抑制率=100%-存活率。采用计算软件(LOGIT 法)计算Chinensiolide A的半数抑制浓度(IC50)值，每个实验重复3 次。
1.3.4 形态学观察比较法 在加药24 h后，加入MTT 10 μL/孔，继续培养4 h后，利用倒置显微镜观察实验组与对照组细胞，进行形态学观察分析。
, 百拇医药
1.4 统计学处理 使用SPSS 21.0统计软件进行分析，计量资料采用(x±s)表示，单因素方差分析(one way ANOVA)进行组间比较，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Chinensiolide A对肺腺癌A549细胞的影响 在浓度1～50 ?mol/L间Chinensiolide A对肺腺癌A549细胞的抑制作用随浓度的增长而增加，存活率依次降低。在10、20 ?mol/L两浓度药物作用下抑制率差距尤为显著，在50 ?mol/L时，Chinensiolide A对人肺癌A549细胞活力的抑制率已高达98.37%，提示Chinensiolide A在低浓度对A549细胞也有较强的抑制作用。Chinensiolide A对人肺癌A549细胞IC50值是17.79 ?mol/L，见表1。
表1 Chinensiolide A对人肺癌A549细胞活力的抑制作用(x±s)%
, 百拇医药
组别存活率抑制率
空白对照组99.99±5.06 0.01±5.06
Chinensiolide A浓度 1 μmol/L99.57±2.22 0.43±2.22
10 μmol/L89.32±3.53*10.68±3.53*
20 μmol/L59.85±3.32*40.15±3.32*
30 μmol/L30.99±3.67*69.01±3.67*
40 μmol/L24.46±2.80*75.54±2.80*
50 μmol/L1.63±0.45*98.37±0.45*
, 百拇医药
*与空白对照组比较，P<0.01；1～50 μmol·L-1Chinensiolide A各组间两两比较，P<0.01
2.2 Chinensiolide A对肝癌Ble-7402细胞的影响 在浓度1～50 ?mol/L浓度范围内，Chinensiolide A对肝癌Ble-7402细胞的抑制率由0.68%升至85.27%，抑制作用随药物浓度的增加而增长，且各浓度组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)，其浓度依赖关系显著。Chinensiolide A对肝癌Ble-7402细胞的IC50值为25.75 ?mol/L，见表2。
表2 Chinensiolide A对人肺癌BEL-7402细胞活力的
抑制作用(x±s) %
组别存活率抑制率
, 百拇医药 空白对照组99.99±1.99 0.01±1.99
Chinensiolide A浓度 1 μmol/L99.32±1.18 0.68±1.18
10 μmol/L84.15±3.53*15.85±3.53*
20 μmol/L67.27±2.37*32.73±2.37*
30 μmol/L52.83±2.64*47.17±2.64*
40 μmol/L34.33±5.04*66.67±5.04*
50 μmol/L14.73±3.22*85.27±3.22*
*与空白对照组比较，P<0.01；1～50 μmol/L Chinensiolide A各组间两两比较，P<0.01, 百拇医药(周黎 赵颖 王玉 李丽波 张树军 李涛)
1.3 实验方法
1.3.1 药液配制 精密称取Chinensiolide A 粉末适量，转至1 mL量瓶中，加入DMSO稀释至刻度，充分溶解，使母液浓度为55 mmol/L。取母液10 μL，加入不含血清的培养基990 μL，稀释至550 μmol/L的工作液。过滤除菌后使用，现用现配。取上述工作液10 μL，加至100 μL细胞液中，终浓度为50 μmol/L，确保DMSO的终浓度不超过0.1%。
1.3.2 细胞培养 将肺腺癌A549细胞、肝癌Ble-7402细胞及结直肠腺癌LoVo细胞分别置于5 mL DMEM培养液的培养瓶中，在37 ℃、体积分数为5%的CO2的培养箱中培养，细胞呈贴壁生长，复苏次日及隔日更换培养液，待细胞至对数生长期进行传代，消化液为0.25%胰蛋白酶与0.02% EDTA[7]。实验选择处于对数生长期的细胞进行研究。
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1.3.3 MTT法测细胞活性 对数生长期的A549细胞、Ble-7402细胞及LoVo细胞，消化后计数制成细胞悬液，浓度为4×104个/mL，取100 μL接种于96孔板中，培养24 h后，加入不同浓度的Chinensiolide A，加样体积为10 μL/孔，对照孔加DMSO，继续培养24 h，然后每孔加入6 mg/mL的MTT磷酸缓冲液10 μL，同条件下继续培养4 h，弃孔内原有液体，加DMSO 150 μL/孔，振荡以充分溶解结晶，用全自动酶标仪测定570 nm处的吸光度(D值)(参比波长630 nm)。以溶剂对照组细胞存活率为100%，计算不同浓度的Chinensiolide A实验组细胞的存活率和抑制率。计算公式如下：存活率=(Chinensiolide A 实验组D值/对照组D值)×100%；抑制率=100%-存活率。采用计算软件(LOGIT 法)计算Chinensiolide A的半数抑制浓度(IC50)值，每个实验重复3 次。
1.3.4 形态学观察比较法 在加药24 h后，加入MTT 10 μL/孔，继续培养4 h后，利用倒置显微镜观察实验组与对照组细胞，进行形态学观察分析。
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1.4 统计学处理 使用SPSS 21.0统计软件进行分析，计量资料采用(x±s)表示，单因素方差分析(one way ANOVA)进行组间比较，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Chinensiolide A对肺腺癌A549细胞的影响 在浓度1～50 ?mol/L间Chinensiolide A对肺腺癌A549细胞的抑制作用随浓度的增长而增加，存活率依次降低。在10、20 ?mol/L两浓度药物作用下抑制率差距尤为显著，在50 ?mol/L时，Chinensiolide A对人肺癌A549细胞活力的抑制率已高达98.37%，提示Chinensiolide A在低浓度对A549细胞也有较强的抑制作用。Chinensiolide A对人肺癌A549细胞IC50值是17.79 ?mol/L，见表1。
表1 Chinensiolide A对人肺癌A549细胞活力的抑制作用(x±s)%
, 百拇医药
组别存活率抑制率
空白对照组99.99±5.06 0.01±5.06
Chinensiolide A浓度 1 μmol/L99.57±2.22 0.43±2.22
10 μmol/L89.32±3.53*10.68±3.53*
20 μmol/L59.85±3.32*40.15±3.32*
30 μmol/L30.99±3.67*69.01±3.67*
40 μmol/L24.46±2.80*75.54±2.80*
50 μmol/L1.63±0.45*98.37±0.45*
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*与空白对照组比较，P<0.01；1～50 μmol·L-1Chinensiolide A各组间两两比较，P<0.01
2.2 Chinensiolide A对肝癌Ble-7402细胞的影响 在浓度1～50 ?mol/L浓度范围内，Chinensiolide A对肝癌Ble-7402细胞的抑制率由0.68%升至85.27%，抑制作用随药物浓度的增加而增长，且各浓度组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)，其浓度依赖关系显著。Chinensiolide A对肝癌Ble-7402细胞的IC50值为25.75 ?mol/L，见表2。
表2 Chinensiolide A对人肺癌BEL-7402细胞活力的
抑制作用(x±s) %
组别存活率抑制率
, 百拇医药 空白对照组99.99±1.99 0.01±1.99
Chinensiolide A浓度 1 μmol/L99.32±1.18 0.68±1.18
10 μmol/L84.15±3.53*15.85±3.53*
20 μmol/L67.27±2.37*32.73±2.37*
30 μmol/L52.83±2.64*47.17±2.64*
40 μmol/L34.33±5.04*66.67±5.04*
50 μmol/L14.73±3.22*85.27±3.22*
*与空白对照组比较，P<0.01；1～50 μmol/L Chinensiolide A各组间两两比较，P<0.01, 百拇医药(周黎 赵颖 王玉 李丽波 张树军 李涛)